藥包材微生物檢驗詳解演示文稿第一頁，共五十一頁。（優(yōu)選）藥包材微生物檢驗第二頁，共五十一頁。微生物的特點個體小,面積大：小于0.1mm。肉眼不可見。分布廣,種類多（10萬多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等,

土壤中的數(shù)量最多。代謝強，轉化快：發(fā)酵乳糖的細菌在1小時內(nèi)可分解其自重1000～10000倍的乳糖；產(chǎn)朊假絲酵母合成蛋白質的能力比食用公牛強10萬倍。生長旺，繁殖快：微生物有驚人的繁殖速度，大多數(shù)微生物幾十分鐘內(nèi)就可以繁殖一代。適應性強，易變異（耐藥性產(chǎn)生的原因）。第三頁，共五十一頁。葡萄球菌

酵母菌（芽痕）棒狀桿菌大腸桿菌弧狀菌鏈球菌第四頁，共五十一頁。菌落單位菌落單位---CFU:由單個菌細胞或幾個同種菌細胞在培養(yǎng)基上長成肉眼可見的菌落，每個菌落就是1CFU細菌菌落霉菌菌落第五頁，共五十一頁。包材的微生物污染包材微生物污染：微生物的產(chǎn)生、附著而給包材及生產(chǎn)環(huán)境帶來不良影響。污染包材的細菌：常見污染包材的細菌是一些生命力較強的細菌，如：葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及一些霉菌，抵抗力弱的細菌一般不易造成污染。包材的微生物污染源：空氣、水、廠房與設備、生產(chǎn)用原輔料、包裝材料、生產(chǎn)操作人員等第六頁，共五十一頁。微生物檢驗一、實驗準備二、培養(yǎng)基的制備三、人流、物流程序四、檢驗步驟方法五、培養(yǎng)觀察與結果判斷第七頁，共五十一頁。潔凈室的啟用

微生物限度檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。在檢驗開始前，應確保：a.潔凈室房間、臺面等已清潔消毒b.潔凈室已臭氧滅菌不少于半小時c.潔凈室凈化空調系統(tǒng)持續(xù)運轉不少于1小時，紫外燈已開啟d.潔凈室中有壓差要求的房間壓差達到規(guī)定實驗準備第八頁，共五十一頁。實驗器材、消耗品的準備a.無菌衣、手套、口罩、試管、瓶子、培養(yǎng)皿、消毒劑配制缸、脫脂棉花球b.一次性薄膜過濾濾器、微生物檢查薄膜過濾儀c.消毒劑、酒精燈第九頁，共五十一頁。培養(yǎng)基是微生物試驗的基礎，直接影響微生物試驗結果。培養(yǎng)基的制備是檢驗的重要一環(huán)。培養(yǎng)基的制備第十頁，共五十一頁。培養(yǎng)基制備過程中的注意事項培養(yǎng)基的水化培養(yǎng)基水化使用的容器應是玻璃器皿或搪瓷器皿如三角燒瓶。蒸餾水洗凈，烘干后方可使用。不得用銅鍋或鐵鍋,以防有離子混入培養(yǎng)基中,影響微生物的生長；配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水,不能含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質；培養(yǎng)基的溶解在培養(yǎng)基分裝滅菌前,應溶解均勻,使用電爐等設備煮沸培養(yǎng)基時,應用小火加熱,并邊加熱邊攪拌,避免培養(yǎng)基焦化或爆沸溢出。培養(yǎng)基的滅菌已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌濕熱滅菌必須嚴格控制滅菌溫度和時間（121度，15-30分鐘，20分鐘）第十一頁，共五十一頁。培養(yǎng)基制備過程中的注意事項培養(yǎng)基的保溫培養(yǎng)基滅菌后應立即取出，不得儲藏在高壓滅菌器中，避免造成過度滅菌,影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。建議用45℃—55℃水浴鍋保溫不得超過8小時（60℃的培養(yǎng)箱，溫度不同，長時間高溫影響培養(yǎng)基質量）。培養(yǎng)基的貯藏配制好的培養(yǎng)基應保存在避光的環(huán)境。一般在三周內(nèi)使用（瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷凍破壞凝膠特性）。固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進行，只允許一次，不得再滅菌。第十二頁，共五十一頁。人流、物流程序物流

將樣品、滅菌后的物品、集菌過濾器等轉移入傳遞窗內(nèi)，打開傳遞窗內(nèi)的紫外燈，照射不少于0.5小時。人流檢驗人員在物品紫外消毒即將結束時，開始進入潔凈室。在更衣室脫去外衣和鞋。清洗雙手后，在物品柜內(nèi)取口罩和手套，戴上口罩。打開滅菌后的無菌衣外包裝，取出無菌衣，穿戴整齊，要求嚴格覆蓋頭發(fā)、胡須和頸部。打開手套外包裝，取出手套戴上，無菌衣袖口應包裹在手套內(nèi)。用更衣室內(nèi)的消毒劑浸泡雙手后，自然揮干。進入緩沖走廊，關閉傳遞窗內(nèi)的紫外燈后，打開傳遞窗的門，取出樣品和其他實驗物品，經(jīng)二級緩沖，進入操作間。開啟超凈工作臺工作電源，關閉紫外燈，并用75%的酒精噴灑擦拭消毒工作臺面。第十三頁，共五十一頁。檢驗步驟方法檢驗方法：平皿法、薄膜過濾法

藥品檢驗三種方法，包材檢驗兩種方法的選用僅與最后結果的報告有關,不影響檢測的準確性。以鋁箔為例，若無菌生長，薄膜法結果為＜1cfu/100cm2，平皿法結果為＜30cfu/100cm2。薄膜法費時費力，但目前標準要求。第十四頁，共五十一頁。藥典要求：采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑一般為50mm。經(jīng)過多次反復實驗，發(fā)現(xiàn)采用75mm濾膜，菌落計數(shù)更方便、清晰。檢驗過程（以常用的薄膜過濾法為例）第十五頁，共五十一頁。75MM濾器第十六頁，共五十一頁。５０MM、75MM薄膜過濾器

第十七頁，共五十一頁。黑曲霉在75MM膜玫瑰紅鈉形態(tài)

第十八頁，共五十一頁。2022/12/1619金葡菌在75MM薄膜形態(tài)75mm薄膜過濾器

第十九頁，共五十一頁。供試液的制備：略過濾：取出三聯(lián)過濾器，將其固定在集菌儀底座上。在火焰附近打開過濾器的針頭，插入供試液瓶中。運行集菌儀調節(jié)泵速，一般在150左右。（供試液過濾前先少量的滅菌水過濾以潤濕濾膜）細菌、霉菌、酵母菌的檢驗：過濾后取出濾膜（水要濾干，防止菌成片生長），菌面朝上貼于相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對照試驗：提取用水代替供試液同法操作。不得有菌生長。檢驗步驟第二十頁，共五十一頁。

培養(yǎng)基的澆注：澆注好的平板搖勻后冷卻備用（不要把平板壘起來，這樣不利于冷卻）可以在細菌培養(yǎng)基中加0.1‰的TTC（利于觀察計數(shù)）第二十一頁，共五十一頁。4.控制菌檢查

大腸埃希菌（常用，一般內(nèi)用藥包裝材料）、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（一般外用藥包裝材料，如聚丙烯藥用滴眼劑瓶）直接將相應培養(yǎng)基加入過濾后的濾筒中培養(yǎng)。陽性對照試驗：同相應控制菌的檢查，加入10-100cfu的對照菌，應檢出相應控制菌。陰性對照試驗：提取用水代替供試液同法操作，不得有菌生長。第二十二頁，共五十一頁。在操作中不應有大幅度或快速的動作；使用玻璃器皿應輕取輕放；在火焰上方操作；帶有菌液的吸管等應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒；使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺面，關閉工作電源，重新開啟紫外燈照射15min。注意事項第二十三頁，共五十一頁。培養(yǎng)觀察與結果判斷培養(yǎng)

培養(yǎng)皿應倒置培養(yǎng)。2010年藥典培養(yǎng)時間溫度的變化：時間修訂為：細菌為3天（原48小時）；霉菌、酵母菌為5天（原72小時），必要時可適當延長培養(yǎng)時間至7天進行菌落計數(shù)。控制菌培養(yǎng)溫度修改為30℃～35℃（原35℃～37℃）第二十四頁，共五十一頁。菌落計數(shù)每片濾膜上的菌落數(shù)應不超過100個（否則要稀釋后過濾）。若濾膜上無菌數(shù)生長，以＜1報告菌數(shù)。若兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上（例20，40需重新檢驗）。第二十五頁，共五十一頁?？刂凭呐袛嗟诙?，共五十一頁。大腸埃希菌的鑒定靛基質試驗MUG試驗第二十七頁，共五十一頁。大腸埃希菌的鑒定曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)瓊脂平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心圓形稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。第二十八頁，共五十一頁。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24h后，呈均勻渾濁生長。分離培養(yǎng)：甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)。卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈。生化反應：

血漿凝固酶試驗結果：＋

金黃色葡萄球菌的鑒定第二十九頁，共五十一頁。金黃色葡萄球菌的鑒定金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂上第三十頁，共五十一頁。金黃色葡萄球菌的鑒定血漿凝固酶試驗第三十一頁，共五十一頁。金黃色葡萄球菌的鑒定血漿凝固酶試驗第三十二頁，共五十一頁。分離培養(yǎng)：十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基生化反應：

氧化酶試驗（＋）

（培養(yǎng)物呈粉紅色漸變?yōu)樽霞t色）綠膿菌素試驗（＋）

（鹽酸溶液呈粉紅色）銅綠假單胞菌的鑒定第三十三頁，共五十一頁。銅綠假單胞菌的鑒定銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂第三十四頁，共五十一頁。菌種的相關知識菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機構，其中國際知識產(chǎn)權組織承認的法定的保藏機構僅有28家。第三十五頁，共五十一頁。1、我國的微生物菌種保藏機構1）普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武漢病毒研究所2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究院，北京，（IFFI）4）醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京中國醫(yī)學科學院病毒研究所5）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國醫(yī)學科學學院抗生素研究所，北京四川抗生素工業(yè)研究所，成都華北制藥廠抗生素研究所，石家莊6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京第三十六頁，共五十一頁。2、國外主要的微生物菌種保藏機構1）美國標準菌種收藏所（ATCC）2）美國冷泉港研究所（CSH）3）日本東京大學應用微生物研究所（IAM）4）日本東京科研化學有限公司（KCC）5）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）6）英國國立標準菌種收藏所（NCTC）7）美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）8）美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（NRRL）第三十七頁，共五十一頁。我國的標準菌種統(tǒng)一由中國菌種保藏管理委員會（CCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗的菌種由醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供美國ATCC、NRRL，荷蘭的CBS第三十八頁，共五十一頁。

中國醫(yī)學菌種保藏中心提供的標準菌株第三十九頁，共五十一頁。

美國國家菌種保藏中心提供的標準菌株第四十頁，共五十一頁。菌種的采購菌種的復蘇菌種的傳代菌種的使用菌種的保藏菌種的銷毀第四十一頁，共五十一頁。菌種的采購向指定的菌種保藏機構購置。所購菌種均為冷凍干燥菌種。

購入菌種后，應及時移交實驗室。實驗室菌種管理人員應仔細核對菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標簽等各項信息，確認無誤后，置4～6℃暫存。第四十二頁，共五十一頁。菌種的復蘇

菌種在打開前應仔細核對標簽上菌名、菌號。并注意一株菌種使用一套打開用具，嚴防交叉污染。

菌種復蘇應在生物安全柜內(nèi)操作。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、可同時接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面。

取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對菌種的純度進行鑒定。第四十三頁，共五十一頁。菌種的復蘇干燥菌種(安瓿)的開啟

第四十四頁，共五十一頁。菌種的傳代應在生物安全柜中進行菌種的傳代。美國藥典（USP）中規(guī)定：“將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，”并規(guī)定“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代”。我國的GMP認證中也如此要求，并且中國藥典2005年版藥典也已做出“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代”這個明確的規(guī)定。第四十五頁，共五十一頁。常用的傳代方法斜面接種劃線接種液體接種穿刺接種

第四十六頁，共五十一頁。菌種的傳代斜面接種時的無菌操作第四十七頁，共五十一頁。微生物的環(huán)境器皿及培養(yǎng)基的無菌操作者的外界環(huán)境及操作過程的無菌（環(huán)境及操作的無菌）劃線接種第四十八頁，共五十一頁。

平板劃線法（streakplatemethod）

第四十九頁，共五十一頁。菌種的使用菌液的制備：

取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置35～37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。

取上述液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，分別10倍稀釋至10-5～10-9，制成含菌數(shù)小10