體外分離培養(yǎng)人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞低能流密度組：體外震波能流密度0.03mJ/mm2,分別彳^用400體外分離培養(yǎng)人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞低能流密度組：體外震波能流密度0.03mJ/mm2,分別彳^用400次和800次。檢測指標：⑴內(nèi)皮細胞成血管能力;⑵內(nèi)皮遷移能力；⑶流內(nèi)皮細胞凋亡情況。左偉，男，1991年生，江西省豐城市人，漢族，北京大學在讀碩士，主要從事骨科研究。并列第一作者：高福強，男,1983年生，山東省濰坊市人，北京大學醫(yī)學部畢業(yè)，博士，主要從事股骨頭壞死的基礎與臨床研究。通訊作者：孫偉，博士，副教授，中日友好醫(yī)院骨科，北京市100029中圖分類號:R318文獻標識碼：A文章編號:2095-4344（2016）37-05504-07稿件接受：2016-06-16中國組織工程研究第20卷第37期2016-09-09出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember9,2016Vol.20,N,研究原著?體外震波對骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響左偉，高福強，李配瑤，孫偉，李子榮，時令軍（中日友好醫(yī)院骨科，北京市100029）引用本文：左偉，高福強，李配瑤，孫偉，李子榮，時令軍.體外震波對骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響[J].中國組織工程研究，2016,20（37）:5504-5510.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.005ORCID:0000-0002-1483-1302（左偉）文章快速閱讀：體外震波對股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞成血管能力、遷移能力及抗凋亡作用的影響高能流密度組：體外震波能流密度0.11mJ/mm2,分別作用400次和800次文題釋義：能流密度：是在一定空間范圍內(nèi)，單位面積（如平方米）所能取得的或單位質(zhì)量（如kg）能源所能產(chǎn)生的某種能源的能量或功率，是評價能源的主要指標之一。體外震波：作為一種特殊類型的外源性物理作用信號，通過刺激、激活內(nèi)皮細胞上機械力學信號感受器，繼而進一步激活細胞內(nèi)特殊信號傳導系統(tǒng)，調(diào)控內(nèi)皮細胞基因表達，而對內(nèi)皮細胞生理功能產(chǎn)生影響。摘要背景：體外震波作為一種特殊類型的外源性物理作用信號，通過刺激、激活內(nèi)皮細胞上機械力學信號感受器，激活細胞內(nèi)特殊信號傳導系統(tǒng)，調(diào)控內(nèi)皮細胞基因表達，對內(nèi)皮細胞生理功能產(chǎn)生影響。目的：觀察不同能流密度及作用次數(shù)體外震波對股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞成血管能力、遷移能力及抗凋亡作用的影響。方法：從關節(jié)置換患者股骨頭獲取股骨頭骨松質(zhì)，分離、培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞。通過血管性血友病因子、CD31血管內(nèi)皮細胞標記物抗體進行免疫熒光鑒定。根據(jù)體外震波不同能流密度（低0.03mJ/mm2,高0.11mJ/mm2）及不同作用次數(shù)（400次，800次）對細胞進行分組。通過細胞3D培養(yǎng)實驗觀察內(nèi)皮細胞成血管能力，劃痕實驗觀察內(nèi)皮遷移能力，流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞凋亡情況。結(jié)果與結(jié)論：①從股骨頭松質(zhì)骨中分離、培養(yǎng)出的細胞均能表達血管性血友病因子、CD31,表明這些細胞具有血管內(nèi)皮細胞的特征，陽性率接近100%;②體外震波作用于股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞提高其體外成血管能力及遷移能力，低能流密度組促進成血管能力和細胞遷移能力顯著優(yōu)于高能流密度組，高能流密度組內(nèi)隨著作用次數(shù)的增加促成血管能力下降；③對于激素誘導股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞凋亡有保護作用；④結(jié)果說明，體外震波對股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響與作用能流密度及作用次數(shù)相關。關鍵詞：組織構(gòu)建；血管內(nèi)皮細胞；體外震波；骨微血管內(nèi)皮細胞；成管實驗；劃痕實驗；流式細胞凋亡實驗主題詞：物理治療技術；微血管；內(nèi)皮細胞；組織工程

ZuoWei,StudyingformastersdegreeDepartmentofOrthopedics,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,ChinaImpactofextracorporealshockwavesonphysiologicalfunctionofbonemicrovascularendothelialcellsZuoWei,StudyingformastersdegreeDepartmentofOrthopedics,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,ChinaZuoWei,GaoFu-qiang,LiPei-yao,SunWei,LiZi-rong,ShiLing-jun(DepartmentofOrthopedics,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,China)GaoFu-qiang,M.D.,DepartmentofOrthopedics,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,ChinaZuoWeiandGaoFu-qiangContributedequallytothiswork.AbstractBACKGROUND:Extracorporealshockwavehasbeenshowntoinfluencethephysiologicalfunctionofendothelialcellsviatheactivationofmechanoreceptorsandspecificsignaltransductionsystem,andgeneexpressionregulation.OBJECTIVE:Toexploretheimpactofdifferentenergyflowdensitiesandnumbersofshotsofextracorporealshockwavesonthenewvesselformationability,migrationcapabilityandapoptosisofbonemicrovascularendothelialcells.Correspondingauthor:SunWei,M.D.,Associateprofessor,DepartmentofOrthopedics,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,ChinaMETHODS:Bonemicrovascularendothelialcellsisolatedfromthefemoralheadofpatientsundergoingarthroplastyweresubculturedinvitro,andthenwereimmunofluorescentlyevaluatedwithendothelialcellmarkerantibodiestoCD31andvonWillebrandfactor(vWF),andgroupedaccordingtodifferentenergyflowdensities(low,0.03mJ/mm2;high,0.11mJ/mm2)andnumbersofshots(400and800).Capillary-liketubeformation,migrationcapabilityandapoptosisofbonemicrovascularendothelialcellsweredeterminedby3-Dcultureinvitro,scratchtest,andflowcytometry,respectively.RESULTSANDCONCLUSION:vWFandCD31werepositivelyexpressedinapproximately100%ofbonemicrovascularendothelialcells,whichindicatestheculturedcellshadcharacterizationofmicrovascularendothelialcells.Extracorporealshockwaveenhancedangiogenesisandmigrationcapabilityofbonemicrovascularendothelialcellsderivedfromthefemoralhead,andespeciallylow-energyflowdensityofextracorporealshockwaveexertedmoresuperioreffects.Angiogenesisofbonemicrovascularendothelialcellswasdecreasedwiththeincreasedshotnumberinthelow-energyflowdensitygroup.Inaddition,extracorporealshockwaveinhibitedbonemicrovascularendothelialcellapoptosisinducedbysteroids.Ourresultssuggestthatenergyflowdensityandnumberofshotsofextracorporealshockwavesimpactthephysiologicalfunctionofbonemicrovascularendothelialcellsderivedfromthefemoralhead.Subjectheadings:PhysicalTherapyModalities;Microvessels;EndothelialCells;TissueEngineeringCitethisarticle:ZuoW,GaoFQ,LiPY,SunW,LiZR,ShiLJ.Impactofextracorporealshockwavesonphysiologicalfunctionofbonemicrovascularendothelialcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(37):5504-5510.0引言Introduction股骨頭缺血性壞死是骨科常見、多發(fā)性疑難疾病。報道表明在未經(jīng)有效治療的患者，隨著病程的進展在1-5年內(nèi)將發(fā)生股骨頭塌陷[1-3],最終只能行關節(jié)置換手術。而近年來隨著對其認識的加深及診療技術的進步，一些骨壞死早期的患者越發(fā)多見。體外震波是近年來用于輔助治療早期骨壞死的常用治療手段[4-8],然而其治療股骨頭壞死的原理至今尚未闡明。既往諸多研究表明骨微血管內(nèi)皮細胞在股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用，發(fā)生壞死股骨頭均存在不同程度的骨微血管內(nèi)皮細胞功能異常，導致股骨頭骨質(zhì)血運異常[9-11],因此探索體外震波對于內(nèi)皮細胞功能的影響具有重要意義。既往諸多研究通常使用臍靜脈內(nèi)皮細胞作為常規(guī)研究對象，然而不同器官部位內(nèi)皮細胞尤其自身功能及結(jié)構(gòu)特異性[12],股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞是股骨頭骨內(nèi)微環(huán)境網(wǎng)絡的重要組成部分，其生理功能的變化直接影響股骨頭骨內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定[13]。實驗首次使用從股骨頭松質(zhì)骨分離、培養(yǎng)的股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞作為實驗細胞，初步探索了體外震波對于股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響。材料和方法Materialsandmethods設計細胞功能學觀察實驗。時間及地點于2015年3至8月在中日友好醫(yī)院臨床研究所完成。材料股骨頭骨松質(zhì)取自于2015年3至5月于中日友好醫(yī)院行關節(jié)置換患者股骨頭。取材納入標準：外傷性股骨頸及轉(zhuǎn)子部骨折、魏關節(jié)骨性關節(jié)炎、先天性腕關節(jié)發(fā)育不良繼發(fā)骨性關節(jié)病。取材排除標準：股骨頭無菌性壞死、強直性脊柱炎、類風濕性關節(jié)炎、累及腕關節(jié)的、血友病腕關節(jié)病變、腕關節(jié)結(jié)核、化膿性感染、以及腕關節(jié)周圍腫瘤等患者。共取股骨頭標本10例，其中股骨頸骨折6例，股骨轉(zhuǎn)子間骨折3例，1例先天性腕關節(jié)發(fā)育不良繼發(fā)骨性關節(jié)炎。所有患者對實驗知情同意，并簽署知情同意書。體外震波實驗用主要試劑及儀器：試劑及儀器來源體外震波儀德國多尼爾公司CO2培養(yǎng)箱GalaxyR,Eppendorf倒置相差顯微鏡OlympusIX713K3O型低溫高速離心機美國Sigma-Aldrich公司胎牛血清浙江天杭生物M199內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基美國HycloneBDMatrigel基質(zhì)膠美國BD公司實驗方法股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞的分離與傳代培養(yǎng)在無菌條件下將用咬骨鉗將股骨頭標本松質(zhì)咬成碎骨，然后將碎骨放入肝素化的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)管中，使用預熱的HBSS液反復多次沖洗，去除油脂及細碎骨質(zhì)。向沖洗干凈的松質(zhì)骨中加入培養(yǎng)基及I型膠原酶(濃度至%-2%),放入37C水浴中靜置6-8h后向其中加入胰蛋白酶(0.25%)-EDTA(0.53mmol/L)消化液(終濃度至胰蛋白酶為0.1%,EDTA終濃度為0.2mmol/L),放入37C水浴中10min。用過濾篩濾除油脂及骨渣并收集細胞液。將收集得到細胞懸液置于20c2000r/min中離心10min。將離心得到沉底細胞混勻于10mL配置好的完全性內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中(配比成分：M199培養(yǎng)基，100U/mL青霉素，含100mg/L鏈霉素，體積分數(shù)20%胎牛血清，40U/mL肝素，10閨/L血管內(nèi)皮細胞生長因子)，得到懸液接種于2%明膠包被的培養(yǎng)皿當中，置于37C和體積分數(shù)5%CO2環(huán)境培養(yǎng)箱中。進行傳代培養(yǎng)時須再次加入胰蛋白酶(終濃度0.1%)和EDTA(終濃度0.2mmol/L)進行消化處理5min,加入M199內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基并收集細胞液置于離心10min,接種至2%明膠包被的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)傳代。方法參照文獻[14]o股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞的鑒定選取血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子1(PECAM-"CD31)和血管性血友病因子作為作為生化標記物[15-16]。取3代細胞接種于明膠包被的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)放置有無菌蓋玻片，待蓋玻片上細胞覆蓋率達50%以上時取出，使用磷酸鹽緩沖液清洗后使用40g/L多聚甲醛固定，使用0.1%三重氫核(Triton)孵育后體積分數(shù)10%胎牛血清封閉1h,加入一抗4c過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗后加入異硫富酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標記的n抗和Hoechst33342。以同型抗體的一抗作為陰性對照。實驗分組和樣品處理選擇上述原代培養(yǎng)的骨微血管內(nèi)皮細胞，傳彳3次后平均分到5個直徑6cm培養(yǎng)皿內(nèi)，在37C,體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中生長至70%-80%細胞融合，隨機分為實驗組和對照組。實驗組根據(jù)不同能流密度：低0.03mJ/mm2(E1)、高0.11mJ/mm2(E2),及不同作用次數(shù)：400次、800次，分為4小組，分次進行細胞體外成管能力實驗及細胞遷移實驗。當行凋亡保護實驗時細胞平均分為6組，對照組當中增加激素對照組。體外成管實驗在經(jīng)設定參數(shù)體外震波作用后，將細胞鋪于鋪有Matrigel(BDBiosciences)的24孔板上，每孔鋪膠60心1,每孔接種的細胞數(shù)為5X104O后將其放入37C、體積分數(shù)5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后分別在2,4,8,12h于共聚焦顯微鏡下觀察成管情況，并于12h拍照記錄成管像。細胞遷移實驗在經(jīng)設定參數(shù)體外震波作用后，內(nèi)皮細胞行劃痕實驗。用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，每隔0.5-1.0cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37C體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后取樣拍照。流式細胞術檢測細胞凋亡原代培養(yǎng)的骨微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)傳代3次，在經(jīng)設定參數(shù)體外震波作用后，繼續(xù)培養(yǎng)72h后加入低齊J量(0.1g/L)氫化可的松[17],再培養(yǎng)24h誘導骨微血管內(nèi)皮細胞損傷。收獲細胞后以4C預冷的流式細胞液(含體積分數(shù)2%牛血清白蛋白的PBS)洗細胞2次制成單細胞懸液。調(diào)整細胞濃度至5X109L-1,取100山細胞懸液加入5心由勺Annexin-FITC(eBioscience)和10心L的20ng/L碘化丙咤(propidiumiodide,PI)溶液，混勻后室溫避光孵育15min,用流式細胞液洗3次后再加入500心疏式細胞液，流式細胞儀檢測熒光強度。用Coulter的流式分析軟件分析活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡和壞死細胞比例并進行分析。1.5主要觀察指標①細胞培養(yǎng)結(jié)果；②體外成管實驗結(jié)果；③骨微血管內(nèi)皮細胞遷移能力；④激素誘導損傷后細胞凋亡比例和存活比例。00000c765430里數(shù)腔管形成圖00000c765430里數(shù)腔管形成圖1細胞培養(yǎng)結(jié)果(M00)Figure1Subcultureofbonemicrovascularendothelialcells(100)x圖注：骨微血管內(nèi)皮細胞成“鋪路石”狀排列。10-0~~___L,對照組E1400E2400E1800E2800圖3體外震波作用后各組細胞成管結(jié)果Figure3Quantificationofcapillary-liketubeformationbybonemicrovascularendothelialcellsinducedbyextracorporealshockwaves圖注：E1400次組、E1800次組及E2400次組成管數(shù)量明顯高于對照組。E1:0.03mJ/mm2,E2:0.11mJ/mm2ABABCDE圖2體外震波作用后細胞成管(M00)Figure2Capillary-liketubeformationbybonemicrovascularendothelialcellsinducedbyextracorporealshockwaves(100)圖注：圖A為E1400次組；B為E2400次組；C為E1800次組；D為E2800次組；E為對照組。E1400次組、E1800次組及E2400次組成管數(shù)量明顯高于對照組。E1:0.03mJ/mm2,E2:0.11mJ/mm2。圖4體外震波對于骨微血管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響(M00)Figure4Theimpactofextracorporealshockwavesonthemigrationcapabilityofbonemicrovascularendothelialcells(M00)圖注：圖A,F示E1400次組體外震波作用后細胞遷移；B,G示E2400次組體外震波作用后細胞遷移；C、H示E1800次組體外震波作用后細胞遷移；D、I示E2800次組體外震波作用后細胞遷移；E、J示對照組細胞遷移。E1:0.03mJ/mm2,E2:20.11mJ/mm。圖5體外震波作用后各組細胞凋亡分布Figure5Bonemicrovascularendothelialcellapoptosismeasuredbyflowcytometryineachgroup圖注：圖A為對照組；B為E1400次組；C為E1800次組；D為E2400次組；E為E2800次組表1各組細胞24h時的劃痕修復比(xis)Table1Scratchtestresultsofeachgroupat24hours組別劃痕修復比E1400次組0.84此08aE1800次組0.78此03E2400次組0.41此06E2800次組0.37此05無體外震波對照組0.45此09表注：與E1800次組和對照組相比，細胞遷移能力增強(aP<0.05)1.6統(tǒng)計學分析采用SPSSl9.0軟件進行統(tǒng)計分析。均數(shù)比較采用非配對t檢驗或者方差分析。當P<0.05為差異有顯著性意義。結(jié)果Results細胞培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)1周后呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀(圖1)。此時可行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)相對一致，呈現(xiàn)長條、多角狀。使用免疫組織化學染色法檢測細胞血管性血友病因子及CD31表達情況，在熒光顯微鏡下觀察見細胞表達血管性血友病因子及CD31接近100%,表明這些細胞為內(nèi)皮細胞。體外成管實^^結(jié)果5組細胞成管數(shù)量比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。組間兩兩相比較，E1400次組、E1800次組及E2400次組成管數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)。E2800次組與對照組相比成管數(shù)差異無顯著性意義(P>0.05)。E1400次組與E1800次組間差異無顯著性意義(P>0.05)。E2400次組與E2800次組間差異有顯著性意義(P<0.05)。E1400次組及E1800次組均與E2400次和E2800次組間差異有顯著性意義(P<0.05),見圖2和圖3。劃痕檢測體外震波對于骨微血管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響在0h時5組鏡下均顯示邊緣整齊的劃痕。24h時5組細胞遷移能力比較，差異有顯著性意義(F=45.48,P<0.05)。組間兩兩相比，E1400次組與E1800次組與對照組相比，細胞遷移能力增強，差異有顯著性意義(P<0.05)。E2400次組與E2800次組與對照組相比，差異無顯著性意義(P>0.05)，見表1和圖4。激素誘導損傷后細胞凋亡比例和存活比例激素誘導前使用E1400次組作用于細胞，早期凋亡細胞比例下降(P<0.05),晚期凋亡及壞死比例下降(P<0.05),活細胞比例上升(P<0.05);激素誘導前使用E1800次組作用于細胞，早期凋亡細胞比例為與對照組比較差異表2激素誘導損傷后各組細胞凋亡比例和存活比例(％)Table2Theimpactofextracorporealshockwavesonsteroids-inducedbonemicrovascularendothelialcellapoptosis組別早期凋亡比例晚期凋亡比例活細胞比例對照組23.0426.7147.69E1400次組13.79a13.80a69.30aE1800次組19.9214.92a62.85aE2400次組22.2920.68a55.44E2800次組20.8322.6354.41表注：E1400次組早期凋亡細胞比例和晚期凋亡及壞死比例顯著下降，活細胞比例上升；E1800次組晚期凋亡比例顯著下降，活細胞比例上升；E2400次組晚期凋亡及壞死顯著下降。與對照組比較，aP<0.05。無顯著性意義(P>0.05),晚期凋亡比例顯著下降(P<0.05),活細胞比例上升(P<0.05)。E2400次組早期凋亡及活細胞比例與對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05),晚期凋亡及壞死顯著下降(P<0.05);E2800次組早期凋亡、晚期凋亡及壞死以及活細胞比例與對照組比較差異均無顯著性意義(P>0.05),見表2,圖5。討論Discussion內(nèi)皮細胞生理功能不僅受到復雜的生化內(nèi)環(huán)境的影響，且持續(xù)受到血流動力所帶來的持續(xù)力學刺激調(diào)才S［18-21］O體外震波作為一種特殊類型的外源性物理作用信號，通過刺激、激活內(nèi)皮細胞上機械力學信號感受器，繼而進一步激活細胞內(nèi)特殊信號傳導系統(tǒng)，調(diào)控內(nèi)皮細胞基因表達，而對內(nèi)皮細胞生理功能產(chǎn)生影響［22-24］O體外震波促進股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞體外成管能力國內(nèi)外諸多報道表明，體外震波可促進內(nèi)皮細胞的體外成管能力。然而對于不同能流密度及不同作用次數(shù)對于體外成管能力的影響尚未有統(tǒng)一認識。Zhang等［25］報道利用低能量(0.012mJ/mm2)1000次體外震波作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞，可顯著促進其體外成管能力，并提出其可能與體外震波激活內(nèi)皮細胞的特異機械感受器，從而促進了成血管因子分泌增加相關。Nishida等［26］提出使用高能量(0.09mJ/mm2)500次作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞，可顯著促進細胞體外成管能力。但上述研究并未做不同能流密度及不同作用次數(shù)的對照研究。而Sansone等［27］首次比較了不同能流密度及作用對成管能力的影響，其結(jié)果表明，當使用低能流密度(0.012mJ/mm2)200次時體外震波促進體外成管能力最為明顯，且隨著作用次數(shù)的增加并未進一步促進體外成管。作者研究表明，在使用低能流密度(0.03mJ/mm2)體外震波作用于可顯著促進股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞的體外成管能力，而不同作用次數(shù)組(400次、800次)之間促進成管能力并無統(tǒng)計學差異。并且研究表明低能流密度組(0.03mJ/mm2)促進成管能力顯著優(yōu)于高能流密度組(0.11mJ/mm2),在高能流密度組內(nèi)隨著作用次數(shù)的增加促成管能力下降。體外震波促進股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞遷移能力此次實驗使用劃痕實驗驗證體外震波對股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響。結(jié)果表明低能流密度(0.03mJ/mm2)400次組及800次組顯著促進細胞遷移能力，但組間結(jié)果并無統(tǒng)計學差異。且低能流密度組2(0.03mJ/mm)促進細胞遷移能力明顯優(yōu)于高能流密度組(0.11mJ/mm2)。并且高能流密度組(0.11mJ/mm2)組與對照組相比未有統(tǒng)計學差異，表明高能流密度組并不能促進體外細胞的遷移能力。此前Zhang等[25]研究結(jié)果表明在使用高能流密體外震波可顯著促進體外臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移能力，此間差異可能與所用細胞不同有關，有待進一步相關試驗驗證。體外震波保護細胞凋亡作用當前諸多研究顯示股骨頭微循環(huán)障礙是股骨頭壞死發(fā)病的主要機制。其中股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞損傷和凋亡被認為是激素性股骨頭血液循環(huán)障礙的始動因素和關鍵環(huán)節(jié)[28]。此前研究建立了低劑量激素誘導骨微血管內(nèi)皮細胞凋亡模型[29]O通過使用低劑量激素誘導骨微血管內(nèi)皮細胞模型，結(jié)果表明當使用E1(0.03mJ/mm2)400次組體外震波干預時細胞早期、晚期及總凋亡細胞數(shù)量減少，活細胞增多，提示此能流密度及作用次數(shù)的體外震波干預能夠保護激素誘導的骨微血管內(nèi)皮細胞凋亡，且與E1(0.03mJ/mm2)800次組結(jié)果并無統(tǒng)計學差異，提示在此能流密度等級體外震波作用下，其作用次數(shù)的增加對內(nèi)皮細胞的生理功能影響無正相關作用。而E2(0.11mJ/mm2)400次組與800次組結(jié)果與激素對照組結(jié)果并于統(tǒng)計學差異，提示使用高能流密度體外震波干預無保護內(nèi)皮細胞凋亡作用。綜上實驗結(jié)果表明，E1(0.03mJ/mm2)體外震波能夠顯著提高股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞的成管及遷移能力，并且能夠有效保護激素誘導所致的細胞凋亡，且E1(0.03mJ/mm2)體外震波對骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響與其作用次數(shù)無正相關性。而在研究中E2組2.(0.11mJ/mm)體外震波并未表現(xiàn)出對股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響，推測可能與高能流密度的機械刺激對內(nèi)皮細胞的損傷作用相關，其具體原因有待進一步研究。作者貢獻：設計為第一作者和通訊作者，實施為全體作者，評估為通訊作者和第一作者，第一作者成文。利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關利益沖突。倫理問題：試驗方案已經(jīng)患者及家屬知情同意。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中￥^及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關協(xié)議。4參考文獻ReferencesMontMA,ZywielMG,MarkerDR,etal.Thenaturalhistoryofuntreatedasymptomaticosteonecrosisofthefemoralhead:asystematicliteraturereview.JBoneJointSurgAm.2010;92(12):2165-2170.LeeMS,HsiehPH,ShihCH,etal.Non-traumaticosteonecrosisofthefemoralhead-fromclinicaltobench.ChangGungMedJ.2010;33(4):351-360.MontMA,RaglandPS,EtienneG.Coredecompressionofthefemoralheadforosteonecrosisusingpercutaneousmultiplesmall-diameterdrilling.ClinOrthopRelatRes.2004;(429):131-138.WongT,WangCJ,HsuSL,etal.CocktailtherapyforhipnecrosisinSARSpatients.ChangGungMedJ.2008;31(6):546-553.WangCJ,KoJY,ChanYS,etal.Extracorporealshockwaveforhipnecrosisinsystemiclupuserythematosus.Lupus.2009;18(12):1082-1086.LinPC,WangCJ,YangKD,etal.Extracorporealshockwavetreatmentofosteonecrosisofthefemoralheadinsystemiclupuserythematosis.JArthroplasty.2006.21(6):911-915.LudwigJ,LauberS,LauberHJ,etal.High-energyshockwavetreatmentoffemoralheadnecrosisinadults.ClinOrthopRelatRes.2001;(387):119-126.YinTC,WangCJ,YangKD,etal.Shockwavesenhancetheosteogeneticgeneexpressioninmarrowstromalcellsfromhipswithosteonecrosis.ChangGungMedJ.2011;34(4):367-374.StarklintH,LaustenGS,ArnoldiCC.Microvascularobstructioninavascularnecrosis.Immunohistochemistryof14femoralheads.ActaOrthopScand.1995;66(1):9-12.KangP,ShenB,YangJ,etal.Circulatingplatelet-derivedmicroparticlesandendothelium-derivedmicroparticlesmaybeapotentialcauseofmicrothrombosisinpatientswithosteonecrosisofthefemoralhead.ThrombRes.2008;123(2):367-373.WangS,AuroraAB,JohnsonBA,etal.Theendothelial-specificmicroRNAmiR-126governsvascularintegrityandangiogenesis.DevCell.2008;15(2):261-271.Collin-OsdobyP.Roleofvascularendothelialcellsinbonebiology.JCellBiochem.1994;55(3):304-309.LarocheM.Intraosseouscirculationfromphysiologytodisease.JointBoneSpine.2002;69(3):262-269.[14]路玉峰，俞慶聲，郭萬首，等.人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞的

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