DNA的復(fù)制與重組一，DNA的復(fù)制*WastonandCrick,1953

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個(gè)最基本的觀點(diǎn)——

在生命有機(jī)體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠(yuǎn)存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。

從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動(dòng)遵循著中心法則。1中心法則2DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。

半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年M.Messelson等用實(shí)驗(yàn)予以了證實(shí)

雙螺旋結(jié)構(gòu)是半保留復(fù)制的分子基礎(chǔ)

3DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstrain）:為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈?zhǔn)?’～3’鏈。隨從鏈（laggingstrain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA是3’～5’鏈。（以原核生物大腸桿菌為例）1.原料：dNTP，Mg++2.雙鏈DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（OriC）上解開雙螺旋。4DNA的復(fù)制過程4.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子單鏈結(jié)合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復(fù)性。7.拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。

I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結(jié)，切口的3’端可通過自由轉(zhuǎn)動(dòng)一周再與5’端磷酸連接，不需ATP。

II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個(gè)部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復(fù)復(fù)制所要求的負(fù)超螺旋狀態(tài)。

(注:拓?fù)湟辉~的含義是指物體或圖象作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。)8.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯(cuò)的功能

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3’OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時(shí)釋出一個(gè)PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’3’

有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯(cuò)配的核苷酸聚合合酶酶I用于于切切除除引引物物RNA,并填填補(bǔ)補(bǔ)留留下下的的空空隙隙有從從5’’————3’’延伸伸多多核核苷苷酸酸鏈鏈的的聚聚合合酶酶的的活活性性；；有從從3’’————5’’外切切酶酶的的活活性性，，以以切切除除可可能能錯(cuò)錯(cuò)配配的的核核苷苷酸酸；；有從從5’’————3’’外切切酶酶的的活活性性，，其其作作用用是是切切除除引引物物聚合合酶酶II活性性弱弱,作用用與與聚聚合合酶酶III相似似有從從5’’————3’’延伸伸多多核核苷苷酸酸鏈鏈的的聚聚合合酶酶活活性性；；有從從3’’————5’’外切切酶酶的的活活性性真核核的的DNA聚合合酶酶真核核DNA的復(fù)復(fù)制制至至少少涉涉及及5種復(fù)復(fù)制制酶酶α、β、γ、δ和ε，其其中中α、δ、ε參與與染染色色體體DNA的復(fù)復(fù)制制。。α有引引物物要要求求；；β負(fù)責(zé)責(zé)DNA的修修復(fù)復(fù)；；γ的功功能能是是線線粒粒體體DNA的復(fù)復(fù)制制。9.DNA連接接酶酶（（ligase）將不不連連續(xù)續(xù)的的DNA片段段以以3’’，5’’磷酸酸二二酯酯鍵鍵連連接接起起來來，，原原核核生生物物通通過過分分解解NAD為NMN和Pi提供供能能量量，，真真核核生生物物則則消消耗耗ATP5原核核生生物物DNA的復(fù)復(fù)制制In1963,JohnCairns’Technique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.ReplicationoftheE.colichromosomeWhatCairns’’experiment(1963)showed:E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.大腸腸桿桿菌菌(E.coli)的OriC復(fù)制制原原點(diǎn)點(diǎn)大腸腸桿桿菌菌基基因因組組的的復(fù)復(fù)制制原原點(diǎn)點(diǎn)位位于于天天冬冬酰酰胺胺合合酶酶和和ATP合酶酶操操縱縱子子之之間間，，全全長長245bp,稱為為oriC。復(fù)制制的的起起始始大腸腸桿桿菌菌DNA復(fù)制制的的步步驟驟復(fù)制制的的延延伸伸復(fù)制制的的終終止止6真核核生生物物DNA的復(fù)復(fù)制制真核核生生物物DNA的復(fù)復(fù)制制特特點(diǎn)點(diǎn)有多處處復(fù)復(fù)制制起起始始點(diǎn)點(diǎn)；在全全部部完完成成復(fù)復(fù)制制之之前前，，各各個(gè)個(gè)起起始始點(diǎn)點(diǎn)上上DNA的復(fù)復(fù)制制不不能能再再開開始始；；DNA復(fù)制制只在在S期進(jìn)進(jìn)行行。復(fù)制制子子相相對(duì)對(duì)較較小小，為為40-100千堿堿基基對(duì)對(duì)。。真核核生生物物DNA的復(fù)制制子被被稱為為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，，長約150bp左右，，包括括數(shù)個(gè)個(gè)復(fù)制制起始始必需需的保保守區(qū)區(qū)。真核生生物DNA復(fù)制的的起始始需要要起始始點(diǎn)識(shí)識(shí)別復(fù)復(fù)合物物（originrecognitioncomplex，ORC）參與與，ORC結(jié)合于于ARS，它是是由6種蛋白白質(zhì)組組成的的啟動(dòng)動(dòng)復(fù)合合物。。真核生生物DNA復(fù)制叉叉的移移動(dòng)速速度大大約只只有50bp/秒。因此，，人類類DNA中每隔隔30,000-300,000bp就有一一個(gè)復(fù)復(fù)制起起始位位點(diǎn)。。已發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的真真核生生物DNA聚合酶酶有15種以上上。在哺乳乳動(dòng)物物細(xì)胞胞中主主要有有5種DNA聚合酶酶，分別別稱為為DNA聚合酶酶α、ββ、γγ、δδ和ε。真核生生物DNA聚合酶酶的特特性比比較性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122-3≥1在細(xì)胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)(?)功能DNA引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA復(fù)制主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制(?)3'→5'外切無無有有有5'→3'外切無無無無無DNA聚合酶酶α主要參參與引引物合合成。。DNA聚合酶酶β活性水水平穩(wěn)穩(wěn)定，，主要要在DNA損傷的的修復(fù)復(fù)中起作作用。。DNA聚合酶酶δ主要負(fù)負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制制。DNA聚合酶酶ε與后隨隨鏈合合成有有關(guān)，，在DNA合成過過程中中核苷苷切除除以及及堿基基的切切除修修復(fù)中中起著著重要要的作作用。。DNA聚合酶酶在線粒粒體DNA的復(fù)制制中發(fā)發(fā)揮作作用。。RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplexPolymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesis二，DNA的重組組第一節(jié)節(jié)概概述述一、DNA重組（recombination）1、概念念：DNA分子內(nèi)內(nèi)或分分子間間發(fā)生生遺傳傳信息息的重重新組組合，，稱為為遺傳傳重組組（geneticrecombination）,或者基基因重重排(generearrangement)。2、意義義：重重組是是遺傳傳學(xué)的的靈魂魂，沒沒有重重組就就沒有有生物物的進(jìn)進(jìn)化；；沒有有重組組也就就沒有有現(xiàn)代代的分分子克克隆技技術(shù)二、DNA重組的的類型型1、同源源重組組（HomologousRecombination）2、位點(diǎn)點(diǎn)特異異性重重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉(zhuǎn)座座（transposition）第二節(jié)節(jié)同源重重組一、概概述1、定義義：兩兩個(gè)DNA分子同同源序序列之之間進(jìn)進(jìn)行的的重組組2、條件件：（1）兩個(gè)個(gè)DNA分子有同源源序列列（相關(guān)關(guān)的酶酶可以以用任任何一一對(duì)同同源序序列為為底物物）（2）兩個(gè)個(gè)DNA分子必須緊緊密接接觸3、發(fā)生生：真核生生物:非姐妹妹染色色單體體交換換相對(duì)對(duì)應(yīng)的的區(qū)域域。原核生生物:依賴recA蛋白，，并形形成Holliday結(jié)構(gòu)Holiday模型（1964年）二、大大腸桿桿菌同同源重重組的的分子子基礎(chǔ)礎(chǔ)（一））RecA1、作用用：可可促進(jìn)進(jìn)單鏈同同化或或單鏈鏈吸收收RecA具有使使DNA單鏈置置換雙雙鏈中中同源源鏈的的能力力特異地地識(shí)別別單鏈鏈DNA，并能能將之之與同同源DNA中的互互補(bǔ)順順序“退火”，同時(shí)時(shí)將另另一條條鏈排排擠出出去（（取代代），，形成成雜種種分子子2、單鏈鏈同化化發(fā)生生的三三個(gè)條條件（1）其中中一個(gè)個(gè)DNA必須存存在單單鏈區(qū)區(qū)（2）其中中一個(gè)個(gè)DNA必須有有一個(gè)個(gè)自由由3’末端（3）此單單鏈區(qū)區(qū)和3’末端必必須位位于兩兩分子子之間間互補(bǔ)補(bǔ)的區(qū)區(qū)域內(nèi)內(nèi)（二））RecBCD復(fù)合體體1、酶的的活性性：（1）核酸外外切酶酶（2）核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶（3）解旋酶酶2、作用用：在Chi位點(diǎn)處處產(chǎn)生生含3ˊ游離未未端單單鏈.（三））Chi位點(diǎn)---RecBCD識(shí)別的的靶位位點(diǎn)5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'是重組組頻率率較高高的部部位E.coli中每隔隔約5~10kb有一個(gè)個(gè)拷貝貝，斷裂和和重連連產(chǎn)生生異源源雙鏈鏈DNA1.同源序序列排排列在在一起起；2.酶切。。通過過核酸酸酶和和RecBCD蛋白復(fù)復(fù)合體體的作作用在在一對(duì)對(duì)同源源DNA上產(chǎn)生生切口口；3.入侵。。含有有3’端切口口的ssDNA被recA蛋白包包裹形形成recA蛋白-ssDNA細(xì)絲；；RecA-ssDNA細(xì)絲尋找相對(duì)對(duì)的DNA雙螺旋上的相相應(yīng)序列。三、Holiday重組模型4.游離端交叉連連接，形成Holliday結(jié)構(gòu)5.通過分支遷移移產(chǎn)生異源雙雙鏈DNA。十字形結(jié)構(gòu)6.空間重排。十十字型兩臂旋旋轉(zhuǎn)180度7.解離(兩種不同方式式)8.修補(bǔ)連接附：基因敲除(Geneknockout)是80年代后半期應(yīng)應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來來的一門新技技術(shù)是指對(duì)一一個(gè)結(jié)構(gòu)已知知但功能未知知的基因，從從分子水平上上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，，將該基因去去除，或用其其它順序相近近基因取代，，然后從整體體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)動(dòng)物，推測相相應(yīng)基因的功功能。基因敲除的技技術(shù)路線如下下：

（1）構(gòu)建重組基基因載體﹔（2）用電穿孔、、顯微注射等等方法把重組組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞胞核內(nèi),基因敲除的靶靶細(xì)胞目前最最常用的是小小鼠ES細(xì)胞（3）用選擇培養(yǎng)養(yǎng)基篩選已擊擊中的細(xì)胞﹔（4）轉(zhuǎn)入假孕母母鼠使其生長長成為轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)進(jìn)行形態(tài)觀察察及分子生物物學(xué)檢測。四細(xì)菌菌的基因轉(zhuǎn)移移與重組3種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合1轉(zhuǎn)化（transformation）定義：細(xì)菌品系由于于吸收了外源源DNA（轉(zhuǎn)化因子））而發(fā)生遺傳傳性狀的改變變現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出出現(xiàn)了供體性性狀的受體細(xì)細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化化子，即轉(zhuǎn)化成功的的菌落。目前已知有二二十多個(gè)種的的G+和G-細(xì)菌具有自然然轉(zhuǎn)化的能力力此過程可以發(fā)發(fā)生在土壤和和海洋環(huán)境中中，可能是自自然界遺傳交交換的重要方方式。（1）轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)是離體的的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞前還還會(huì)被酶解成成更小的片段段，約8kb。在不同的微生生物中，轉(zhuǎn)化化因子的形式式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何種情情況，最易與與細(xì)胞表面結(jié)結(jié)合的仍是dsDNA。由于每個(gè)細(xì)胞胞表面能與轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化因子相結(jié)結(jié)合的位點(diǎn)有有限（如肺炎炎鏈球菌約10個(gè)），因此，，從外界加入入無關(guān)的dsDNA就可競爭并干干擾轉(zhuǎn)化作用用。質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化因子，但但它們通常并并不能與核染染色體組發(fā)生生重組。轉(zhuǎn)化的頻率通通常為0.1％～1％，最高為20％。（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔孔、基因槍法法等是常用的人人工轉(zhuǎn)化手段段（使細(xì)胞膜膜更易于透過過DNA）。在自然轉(zhuǎn)化的的基礎(chǔ)上發(fā)展展和建立的一一項(xiàng)細(xì)菌基因因重組手段，，是基因工程程的奠基石和和基礎(chǔ)技術(shù)。。用多種不同的的技術(shù)處理受受體細(xì)胞，使使其人為地處處于一種可以攝取外外源DNA的“人工感受態(tài)態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效效率高（不像線型DNA那樣易于降解解，而且還能能在宿主中復(fù)復(fù)制。任何來來源的DNA將其連接到質(zhì)質(zhì)粒上都能進(jìn)進(jìn)入受體細(xì)胞胞）.定義：噬菌體體DNA被感受態(tài)細(xì)胞胞攝取并產(chǎn)生有活性性的病毒顆粒粒。（3）轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的過程也也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體體DNA以轉(zhuǎn)化的（而而非感染）途途徑進(jìn)入微生生物細(xì)胞并表表達(dá)后產(chǎn)生完完整的病毒顆顆粒。特點(diǎn)：2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部部分缺陷噬菌菌體為媒介，，把供體細(xì)胞胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)細(xì)胞中，通過過交換與整合合，使后者獲獲得前者部分分遺傳性狀的的現(xiàn)象。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而而獲得供體細(xì)細(xì)胞部分遺傳傳性狀的重組組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）攜帶供體部分分遺傳物質(zhì)（（DNA片段）的噬菌菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。。細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）、普遍遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過極少數(shù)完完全缺陷噬菌菌體對(duì)供體菌菌基因組上任任何小片段DNA進(jìn)行誤包，而而將其遺傳性性狀傳遞給受受體菌的現(xiàn)象象，稱普遍性性轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)模型（2）.局局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）定義：通過部分缺陷陷的溫和噬菌菌體把供體菌菌的少數(shù)特定基因攜帶帶到受體菌中中，并與后者者的基因組整合、重組組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)子的現(xiàn)象。。媒介：部分缺陷噬菌菌體（丟失自身一一部分基因，，并被同等長度的宿宿主基因所取取代）只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個(gè)別別特定基因大腸桿菌中λ噬菌體的正常常裂解及半乳乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)噬菌體的形形成過程3、接合(conjugation)通過細(xì)胞與細(xì)細(xì)胞的直接接接觸而產(chǎn)生的的遺傳信息的的轉(zhuǎn)移和重組組過程（1）.接合合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)和證實(shí)1946年，，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細(xì)菌的多重營營養(yǎng)缺陷型雜雜交實(shí)驗(yàn)中間平板上長長出的原養(yǎng)型型菌落是兩菌株之間間發(fā)生了遺傳傳交換和重組所致?。榱藴p少所培培養(yǎng)的結(jié)果是是回復(fù)突變的的機(jī)會(huì)，采用用了雙重或三三重營養(yǎng)缺陷陷型。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)是建立在不不大可能同時(shí)時(shí)發(fā)生兩種或或三種回復(fù)突突變的設(shè)想上上的。證實(shí)接合過程程需要細(xì)胞間間的直接接觸觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）大腸桿菌的接接合型與接合合F＋菌株第三節(jié)位位點(diǎn)特異異性重組一、定義：不依賴于DNA順序的同源性性，而依賴于于能與某些酶酶相結(jié)合的特異的DNA序列的存在。。二、噬菌體λ對(duì)E.coliDNA的整合（一）λDNA存在兩種形式式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位位點(diǎn)特異性重重組實(shí)現(xiàn)兩種種類型間的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換λDNA整合到宿主DNA進(jìn)入溶源狀態(tài)態(tài)λDNA從宿主DNA中切離進(jìn)進(jìn)入裂解狀狀態(tài)（三）催化重組組的酶1、整合酶Int(integrase)：有拓?fù)洚悩?gòu)構(gòu)酶活性2、整合宿主因因子（IHF，integrationhostfactor）3、切除酶（excisionase）/終止重重組（四））重組組位點(diǎn)點(diǎn)：附著位位點(diǎn)（（attachmentsite）attP（POP’）和attB（BOB’）有15bp核心序序列配配對(duì)（五））重組組過程程：1、整合合：POP’+BOB’’→→BOP’’—POB2、切離離：BOP’——POB’’→→POP’+BOB’’attPattBattPattB第四節(jié)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)座座一、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子子（transposon）的定定義：：存在于于染色色體DNA上可自自主轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移座座位的的基本本單位位二、轉(zhuǎn)座子子發(fā)現(xiàn)：：McClintockB：1938年，提提出轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座基基因概概念1983年，獲獲諾貝貝爾生生理醫(yī)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獎(jiǎng)J.Shapiro等：1980年，證證實(shí)了了可移移位的的遺傳傳基因因存在在三、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子子的類類型1、IS（插入入序列列,insertionsequences）特點(diǎn)（（1）比較較小，，0.75~1.5kb;（2）只有有轉(zhuǎn)座座酶基因因（3）兩端端有有反反向向重重復(fù)復(fù)序序列列;IR（invertedrepeat）ISTransposaseIR插入入序序列列的的基基本本結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)特特點(diǎn)點(diǎn)a、自自身身攜攜帶帶