氟代苯硼酸與單糖間結(jié)合規(guī)律探究呂辰晨;劉震【摘要】取代硼酸與順式二羥基化合物間的相互作用是設(shè)計(jì)親和配基、功能材料和傳感元件以分離、富集和識(shí)別順式二羥基化合物的重要基礎(chǔ).氟代苯硼酸在較低pH條件下具有較高的硼親和力，但其與單糖間的相互作用規(guī)律目前尚未得到闡明.本研究以親和毛細(xì)管電泳為相互作用表征手段,研究了9種不同結(jié)構(gòu)的氟代苯硼酸與3種典型單糖(甘露糖、果糖和葡萄糖)在不同pH條件下的結(jié)合常數(shù).同時(shí)，利用紫外分光光度法測(cè)量了這9種氟代苯硼酸的酸度系數(shù).經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)-性能關(guān)聯(lián),對(duì)氟代苯硼酸與甘露糖、果糖和葡萄糖的結(jié)合規(guī)律以及對(duì)葡萄糖的選擇性進(jìn)行了探討.【期刊名稱】《分析化學(xué)》【年(卷)，期】2015(043)010【總頁(yè)數(shù)】6頁(yè)(P1459-1464)【關(guān)鍵詞】氟代苯硼酸;單糖;相互作用;親和毛細(xì)管電泳【作者】呂辰晨;劉震［作者單位】北京微量化學(xué)研究所，北京100091;南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及生命化學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210023【正文語(yǔ)種】中文1引言取代硼酸分子對(duì)順式二羥基結(jié)構(gòu)具有特異性識(shí)別作用,被廣泛應(yīng)用于糖、糖蛋白、修飾核首、RNA等生物分子傳感［1?4］和分離富集［5~8］研究中，近年來(lái)在親和分離［9~14］、蛋白質(zhì)組學(xué)［15-19］.代謝組學(xué)［20~23］、疾病診斷［24-27］以及固相標(biāo)記［28］方面得到了越來(lái)越多的重要應(yīng)用。生物樣品多為酸性到偏堿性，而且其中含有的順式二羥基生物分子的豐度低，因硼酸酚基的適用pH范圍寬、親和力高,在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。研究取代硼酸與單糖分子間相互作用規(guī)律,對(duì)于選擇合適配基具有重要指導(dǎo)意義。由于氟原子的特殊結(jié)構(gòu)和電子效應(yīng)，氟取代被廣泛用于藥物設(shè)計(jì)、功能材料等領(lǐng)域中的分子改性，起到增強(qiáng)分子代謝穩(wěn)定性、改變官能團(tuán)理化性質(zhì)和穩(wěn)定分子構(gòu)象等作用［29,30］。Yan等［31］考察了鹵素取代對(duì)硼親和力的影響，結(jié)果表明，氟取代的苯硼酸的親和力比氯取代和漠取代的高得多。本研究組在前期工作中發(fā)現(xiàn),氟取代能增強(qiáng)苯硼酸在低pH條件下的親和力［32］。然而，氟取代的位置和數(shù)目對(duì)苯硼酸的親和力影響，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,深入研究氟取代苯硼酸的性質(zhì)及其與順式二羥基分子間的相互作用規(guī)律具有重要意義。親和毛細(xì)管電泳(Affinitycapillaryelectrophoresis,ACE)是一種基于被分析物結(jié)合前后電泳淌度的變化，表征分子間相互作用的毛細(xì)管電泳方法，具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、快速、高通量及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［33］。ACE已被證明是表征取代硼酸與含順式二羥基生物分子間相互作用的可靠手段［32］.本研究選擇3種典型單糖(甘露糖、果糖和葡萄糖)及9種氟代苯硼酸為研究對(duì)象，利用ACE考察它們間的相互作用，通過(guò)結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系，分析了氟代苯硼酸與單糖間相互作用與分子結(jié)構(gòu)間的關(guān)系規(guī)律。硼酸探針?lè)肿訖z測(cè)血液中葡萄糖時(shí)，果糖為主要干擾物，本研究考察了氟取代苯硼酸對(duì)葡萄糖/果糖的選擇性。2實(shí)蛔分2.1儀器與試劑2-氟苯硼酸(2-FPBA)、3-氟苯硼酸(3-FPBA)、4-氟苯硼酸(4-FPBA)、2,3-二氟苯硼酸(2,3-DFPBA)、2,4-二氟苯硼酸(2,4-DFPBA)、2,5-二氟苯硼酸(2,5-DFPBA)、2,6-二氟苯硼酸(2,6-DFPBA)、3,5-二氟苯硼酸(3,5-DFPBA)、2-(三氟甲基)苯硼酸(2-TFPBA),均購(gòu)自百靈威公司，純度大于97%;苯硼酸和二甲亞礪(DMSO,分析純，上海國(guó)藥集團(tuán));D-甘露糖(純度為99%,AlfaAesar公司);D-果糖(上海惠興試劑公司)。以上試劑均未經(jīng)處理直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水(Millipore公司)，所有溶液使用前用0.45pm濾膜過(guò)濾。ACE實(shí)驗(yàn)在P/ACEMDQ系統(tǒng)(美國(guó)BeckmanCoulter公司)上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用毛細(xì)管(河北永年銳洋色譜器件有限公司)規(guī)格為60cmx50pmi.d.(50cm至檢測(cè)器)。若無(wú)特殊說(shuō)明，ACE實(shí)驗(yàn)是在25。。下進(jìn)行，分離電壓為24kV,二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。每次電泳實(shí)驗(yàn)前,依次使用0.1mol/LNaOH溶液在137.9kPa條件下沖洗2min,運(yùn)行緩沖溶液沖洗2min。進(jìn)樣采用3.447kPa,5s。Nanodrop-2000C微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1親和毛細(xì)管電泳原理硼酸配基(T)與單糖分子(L)通常以1:1的化學(xué)計(jì)量比反應(yīng)，反應(yīng)式和結(jié)合常數(shù)(Ka)如式(1)所示：當(dāng)單糖分子大大過(guò)量時(shí)，單糖分子與氟代苯硼酸分子結(jié)合的比例([TL]/[T0])可以用未結(jié)合單糖濃度([Lf])和結(jié)合常數(shù)(Ka)表示：實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)行緩沖溶液為添加了不同濃度單糖的緩沖鹽溶液,樣品為氟代苯硼酸溶液，電泳運(yùn)行過(guò)程中，形成結(jié)合/解離動(dòng)態(tài)平衡。該動(dòng)態(tài)平衡的形成使氟代苯硼酸的電泳淌度發(fā)生變化。不同的單糖濃度下，氟代苯硼酸分子的測(cè)量電泳淌度(pi)可視為未結(jié)合單糖的氟代苯硼酸分子淌度(pf)與氟代苯硼酸-單糖結(jié)合產(chǎn)物淌度(pb)的表觀表現(xiàn),如式⑶:其中,v為粘度校正因子，八和門0分別為緩沖鹽溶液與添加了一定濃度單糖的緩沖溶液的粘度。樣品中添加DMSO作為電滲流指示劑，以獲得目標(biāo)分子的準(zhǔn)確電泳淌度。聯(lián)立式(2)和式⑶，可得到測(cè)量電泳淌度(|ui)與單糖添加濃度(［Lf］)和結(jié)合常數(shù)(Ka)之間的關(guān)系：當(dāng)單糖分子對(duì)于硼酸分子大大過(guò)量時(shí)，式(4)中的［Lf］可使用單糖濃度代替。(vpii-曲是實(shí)測(cè)的氟代硼酸分子的淌度變化值，ffo(pb-滸)是硼酸分子與單糖完全結(jié)合后與未結(jié)合硼酸分子間的淌度差值，對(duì)于給定硼酸-糖體系為常數(shù)。通過(guò)改變運(yùn)行緩沖溶液中的單糖濃度,可以獲得一系列硼酸分子淌度變化值與單糖濃度間關(guān)系的數(shù)據(jù)，根據(jù)式(4),用雙曲線方程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，獲得結(jié)合常數(shù)Ka的值。2.2.2親和毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)方法電泳運(yùn)行緩沖溶液為添加不同濃度單糖分子的50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH6.0,7.0或8.0)，樣品使用含有0.1%DMSO的單個(gè)或多個(gè)硼酸的溶液，濃度為10-5~10-4mol/L。對(duì)于糖含量大于50mmol/L的運(yùn)行緩沖溶液，均對(duì)測(cè)得的淌度數(shù)據(jù)進(jìn)行粘度校正，以排除粘度變化對(duì)淌度的影響［34,35］。2.2.3數(shù)據(jù)分析表觀淌度數(shù)據(jù)由與電泳儀配套的32Karat軟件計(jì)算得到。非線性數(shù)據(jù)分析使用Origin-Pro8軟件(OriginLabCorporation,USA)。結(jié)合常數(shù)數(shù)據(jù)均由3次實(shí)驗(yàn)的平均值回歸得到。2.2.4酸度系數(shù)(pKa)的測(cè)量取代硼酸的pKa值利用紫外吸光光度法測(cè)量。酉己制一系列不同pH值的取代硼酸溶液(取代硼酸濃度：3,5-DFPBA為5mmol/Lz其余10mmol/L,不同pH值溶液硼酸濃度保持一致;緩沖溶液：50mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4溶液),測(cè)量270nm處的紫外吸光度，對(duì)pH值作圖，得到pKa值。3結(jié)果與討論3.1硼酸酸度的測(cè)量通常認(rèn)為取代硼酸與糖結(jié)合的最佳pH值略高于取代硼酸pKa值，因此pKa值可作為選擇結(jié)合pH值的參考依據(jù)［36］.通過(guò)測(cè)量不同pH值下氟代苯硼酸270nm處的紫外吸光度，得到了不同含氟取代苯硼酸的pKa值俵1)。其中,苯硼酸、4-氟苯硼酸、2,4-二氟苯硼酸和2,5-二氟苯硼酸的結(jié)果與文獻(xiàn)［32］一致。苯環(huán)單氟取代可使硼酸pKa值降低0.1~1.2個(gè)pH單位,二氟取代可使硼酸pKa值降低1.3~1.9個(gè)pH單位。鄰位三氟甲基取代苯硼酸與文獻(xiàn)報(bào)道的酸性較強(qiáng)的鄰位氨基甲基取代苯硼酸［37］和鄰位羥基甲基取代苯硼酸［38］結(jié)構(gòu)類似，但卻沒(méi)有測(cè)得預(yù)期中的低pKa值，pKa值與苯硼酸相比反而升高了一個(gè)單位，可能是空間位阻效應(yīng)阻礙硼酸電離，也可能是三氟甲基能夠穩(wěn)定平面三角形的硼酸結(jié)構(gòu),具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。表1氟代苯硼酸的pKa值Table1pKavaluesoffluorophenylboronicacids取代硼酸Boronicacid結(jié)構(gòu)Structure酸度系數(shù)pKaimages/BZ_131_1612_1263_1708_1392.png)2苯硼酸Phenylboronicacid,PBA8.92-(三氟甲基)苯硼酸2-(Trifluoromethyl)phenylboronicacid,-TFPBA2-氟苯硼酸2-Fluorophenylboronicacid,2-FPBA3-氟苯硼酸-Fluorophenylboronicacid,3-FPBA4-氟苯硼酸4-Fluorophenylboronicacid,4-FPBA2z3-二氟苯硼酸2,3-Difluorophenylboronicacid,2,3-DFPBA2,4-二氟苯硼酸2,4-Difluorophenylboronicacid,2,4-DFPBA2,5-二氟苯硼酸2,5-Difluorophenylboronicacid,2,5-DFPBAimages/BZ_131_1624_1410_1728_1544.pngimages/BZ_131_1612_1568_1702_1720.png)2images/BZ_131_1605_1759_1725_1896.pngimages/BZ_131_1620_1919_1730_2062.pngimages/BZ_131_1600_2090_1731_2217.pngimages/BZ_131_1607_2235_1742_2363.pngimages/BZ_131_1618_2399_173l_2508.png8.87.07.67.22,6-二氟苯硼酸2,6-Difluorophenylboronicacid,2,6-DFPBAimages/BZ_131_1601_2527_1740_2669.png7.03,5-二氟苯硼酸3,5-Difluorophenylboronicacid,3,5-DFPBAimages/BZ_131_1612_2689_1732_2816.png7.63.2氟代苯硼酸與甘露糖結(jié)合常數(shù)甘露糖是糖基化蛋曰末端最常見(jiàn)的單糖，研究氟代苯硼酸與甘露糖的結(jié)合規(guī)律具有重要意義。苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)較?。?2］,實(shí)驗(yàn)測(cè)得氟取代能使苯硼酸與甘露糖的結(jié)合能力最大提高20倍俵2),但結(jié)合作用依然較弱，僅勉強(qiáng)達(dá)到中等結(jié)合強(qiáng)度［36］。結(jié)合氟代苯硼酸的pKa值，pH8.0時(shí)，二氟取代苯硼酸的硼酸根主要以四面體結(jié)構(gòu)存在，提高溶液的堿性無(wú)法再明顯提高硼酸親和能力。親和毛細(xì)管電泳測(cè)量硼酸親和作用具有高通量、高準(zhǔn)確度、適用于不同取代硼酸分子之間親和能力強(qiáng)弱比較的優(yōu)勢(shì)［32］,利用該技術(shù)對(duì)5種二氟取代苯硼酸的結(jié)合能力進(jìn)行了進(jìn)一步區(qū)分。2,3-二氟苯硼酸、2,4-二氟苯硼酸、2,5-二氟苯硼酸與甘露糖的結(jié)合強(qiáng)弱與氟取代對(duì)其pKa值影響基本一致，而2,6-二氟苯硼酸和3,5-二氟苯硼酸與甘露糖的親和能力強(qiáng)弱與酸度不一致，說(shuō)明位阻對(duì)硼酸與甘露糖的結(jié)合有明顯影響。表2氟代苯硼酸與單糖間的結(jié)合常數(shù)(Ka,L/mol)Table2Associationconstant(Ka,L/mol)valuesforfluorophenylboronicacid-monosaccharidebinding取代硼酸Boronicacid甘露糖Mannose果糖Fructose葡萄糖Glucose41.2±0.42-TFPBA1.7±0.27.1±2.32.6±1.03.6±0.48.7±0.6629±3241.1±0.42-FPBA3.0±0.125.2±1.391.7±1.469.0±2.7510±71445±13112.3±1.03-FPBA1.7±0.216.4±0.874.6±2.152.0±1.4377±61599±407.4±0.84-FPBA1.1±0.34.5±0.937.8±0.720.1±0.6136±6787±122.0±0.42,3-DFPBA15.0±0.678.4±2.874.1±3.8228±141132±431867±13253.6±7.42,4-DFPBA5.8±0.233.8±2.1-109±2685±121438±61818.4±1.02,5-DFPBA15.3±1.551.6±5.092.4±1.9254±91153±511498±16845.9±3.22,6-DFPBA5.6±0.430.2±2.147.0±6.6109±2578±101720±20013.9±1.03,5-DFPBA9.2±0.854.3±2.461.8±1.3182±41009pH7.0PBA-3.4±0.229.7±0.98.3±0.299.7±4.3602±1pH6.0pH7.0pH8.0pH6.0pH7.0pH8.0±152093±30029.1±1.3鄰位三氟取代甲基苯硼酸,具有與Wulff型苯硼酸［36］和改進(jìn)Wulff型苯硼酸［37］相似的結(jié)構(gòu)，如果與硼酸官能團(tuán)之間存在電子效應(yīng)，可能會(huì)對(duì)硼酸的親和作用有較大影響。從結(jié)合常數(shù)的數(shù)值可知，pH7.0時(shí)，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)是苯硼酸的兩倍;而pH8.0時(shí)，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)不升反降,說(shuō)明在pH7.0和pH8.0時(shí)鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合作用機(jī)理可能發(fā)生了變化。3.3氟代苯硼酸與果糖結(jié)合常數(shù)果糖是單糖中與硼酸結(jié)合力最強(qiáng)的分子,可用于比較不同取代硼酸親和能力。測(cè)量了氟代苯硼酸與果糖在弱酸性(pH6.0).中性(pH7.0)和弱堿性(pH8.0)條件下的結(jié)合常數(shù)。對(duì)于單氟取代硼酸,在弱酸性和中性條件下，鄰、間、對(duì)位取代苯硼酸結(jié)合能力與其酸度一致;弱堿性(pH8.0)條件下，間位氟取代苯硼酸與果糖的結(jié)合能力超過(guò)了鄰位氟取代苯硼酸。對(duì)于二氟取代苯硼酸，在中性和弱酸性條件下,2,3--?苯硼酸、2,5-二氟苯硼酸、3,5-二氟苯硼酸與果糖的結(jié)合能力基本相當(dāng),2,4-二氟苯硼酸、2,6-二氟苯硼酸與果糖的結(jié)合常數(shù)僅為另外3種氟代硼酸結(jié)合常數(shù)的1/2,與硼酸酸度強(qiáng)弱不完全一致。在弱堿性條件下，鄰位氟取代的優(yōu)勢(shì)逐漸喪失，3,5-二氟苯硼酸具有最強(qiáng)的親和能力，說(shuō)明二氟取代苯硼酸與果糖結(jié)合強(qiáng)弱是電子效應(yīng)和空間位阻共同作用的結(jié)果。鄰位三氟取代甲基苯硼酸,在中性和弱酸性條件下，與果糖的結(jié)合作用十分弱（中性條件下結(jié)合常數(shù)不到苯硼酸的1/10）.而在弱堿性條件下，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與果糖結(jié)合能力迅速增強(qiáng)，與苯硼酸接近。關(guān)于果糖與苯硼酸的強(qiáng)結(jié)合能力，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為源自其占主導(dǎo)地位的含順式鄰位二羥基結(jié)構(gòu)的吠喃糖形式，使二羥基間角度更適合與硼酸形成硼酸酯五元環(huán)［39,40］;但也有研究認(rèn)為,果糖的順式鄰二羥基結(jié)構(gòu)與硼酸成酯的同時(shí)，環(huán)外羥基與硼原子配位增強(qiáng)硼酸酯穩(wěn)定性，使結(jié)合能力強(qiáng)于其它單糖［40］,同時(shí)受鄰位基團(tuán)的影響更加明顯［41］。鄰位三氟甲基苯硼酸與果糖間相互作用的異常現(xiàn)象佐證了第二種觀點(diǎn),在中性和弱酸性條件下，苯硼酸與果糖的結(jié)合受益于果糖環(huán)外羥基與硼原子配位,三氟甲基巨大的位阻效應(yīng)阻止了配位鍵的形成;而在弱堿性條件下，硼酸酯穩(wěn)定性增強(qiáng)，受配位作用影響減弱，鄰位三氟甲基苯硼酸與果糖結(jié)合能力增強(qiáng)。3.4含氟苯硼酸對(duì)葡萄糖的結(jié)合選擇性葡萄糖為人血液中濃度最高的糖，也是糖尿病檢測(cè)的標(biāo)志物。葡萄糖與取代硼酸的結(jié)合作用通常較弱，因此許多研究［2,42］以提高取代硼酸與葡萄糖的結(jié)合能力和選擇性為目標(biāo)。盡管血液中果糖濃度低，但由于果糖與硼酸的結(jié)合常數(shù)通常較葡萄糖高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，因此為血糖檢測(cè)的主要干擾物。葡萄糖主要以毗喃糖形式存在,而果糖主要以味喃糖形式存在。早期研究葡萄糖探針?lè)肿拥奈墨I(xiàn)對(duì)硼酸探針?lè)肿优c葡萄糖毗喃糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析［43］,但后來(lái)的研究多證實(shí)葡萄糖也是以味喃糖形式與硼酸結(jié)合［42,44］。葡萄糖探針?lè)肿佣酁槎鹚岱肿?，與葡萄糖的兩組)11頁(yè)式二羥基結(jié)構(gòu)結(jié)合［42,44］,使探針?lè)肿优c葡萄糖的結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)高于其它以毗喃糖為主要形式的單糖分子，如甘露糖、半孚I；糖，但抗果糖干擾能力差［2］。果糖與取代硼酸分子的結(jié)合受鄰位基團(tuán)的影響較大，通過(guò)在苯硼酸鄰位引入取代基團(tuán),可以提高葡萄糖/果糖的相對(duì)結(jié)合能力［41］。本研究表征了不同位置氟取代苯硼酸與葡萄糖在中性條件下的結(jié)合常數(shù)。氟取代苯硼酸的結(jié)合常數(shù)如表2所示，果糖與葡萄糖在中性條件下的相對(duì)結(jié)合能力數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。由氟取代苯硼酸與葡萄糖的結(jié)合常數(shù)可知，鄰位氟取代和二氟取代均可使硼酸與葡萄糖在中性條件下的親和常數(shù)提高一個(gè)數(shù)量級(jí)及以上。由表3可見(jiàn)，氟取代提高了苯硼酸在中性條件下對(duì)葡萄糖的選擇性;通常，鄰位有取代基的苯硼酸對(duì)葡萄糖的選擇性較高(2,6-二氟苯硼酸除外);鄰位三氟甲基苯硼酸與葡萄糖的結(jié)合能力與苯硼酸相似，但其在中性條件下與果糖的結(jié)合受到抑制，取代硼酸具有對(duì)葡萄糖最高的選擇性。表3果糖與葡萄糖在中性條件下的相對(duì)結(jié)合能力Table3Relativebindingstrengthoffluorophenylboronicacidstowardfructose(Fru)overglucose(Glu)取代硼酸Boronicacids結(jié)合常數(shù)比(果糖/葡萄糖)Ka(D-Fru)/Ka(D-Glu)取代硼酸Boronicacids結(jié)合常數(shù)比(果糖/葡萄糖)Ka(D-Fru)/Ka(D-Glu)PBA83.82-TFMPBA7.62-FPBA41.43-FPBA50.74-FPBA68.32,3-DFPBA21.12,4-DFPBA37.12,5-DFPBA25.12,6-DFPBA41.63,5-DFPBA34.64結(jié)論本研究表征了9種氟代苯硼酸與3種典型單糖在不同pH條件下的結(jié)合常數(shù)，并測(cè)量了這9種氟代苯硼酸的酸度系數(shù),通過(guò)結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)聯(lián)，剖析了氟取代位置與硼酸親和能力強(qiáng)弱之間的關(guān)系。此外,本研究還考察了鄰位三氟甲基對(duì)硼酸電離和成酯的抑制作用,以及對(duì)葡萄糖的較高選擇性。以上研究為設(shè)計(jì)和利用高親和力硼酸配基提供了重要依據(jù)。References【相關(guān)文獻(xiàn)】NishiyabuR,KuboY,JamesTD,FosseyJS.Chem.Commun.,2011,47:1106?1123LiuYfDengC,TangL,QinA,HuR,SunJZ,TangBZJ.Am.Chem.Soc.,2011f133:66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