Westernblot實驗技術(shù)

Westernblot實驗技術(shù)Westernblot原理WesternBlot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。Westernblot原理WesternBlot采用的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺凝膠成份分子篩效應(yīng)凝膠濃度，凝膠孔徑↓，機械強度TEMED促使AP形成氧自由基，進而催化Acr單體為長鏈，Bis再使長鏈彼此聯(lián)成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠（PAG）。AP-TEMED系統(tǒng)單體：丙烯酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）催化劑：過硫酸銨（AP）誘發(fā)劑：四甲基乙二胺（TEMED）氧自由基聚丙烯酰胺凝膠注：O2為終止劑分子篩效應(yīng)凝膠濃度，凝膠孔徑↓，機械強度TEMED促使A-+上樣緩沖液（Loadingbuffer）濃縮膠分離膠Tris/HClpH6.8Tris/HClpH8.8[Tris-HClpH6.8;甘油；SDS；巰基乙醇；溴酚藍]

轉(zhuǎn)膜緩沖液（transferbuffer）

[tris-HCl;glycine]電泳緩沖液（runningbuffer）

[tris-HCl;glycine;SDS](Acrylamide;bis;SDS;AP;TEMED)SDS“兩膠三緩沖”sample電泳三離子：glycine-Cl-

Protien-SDS----------------帶負電的蛋白膠束“消除電荷差、構(gòu)像差”-+上樣緩沖液（Loadingbuffer）濃分Tris/-+濃縮膠分離膠pH6.8pH8.8SDSCl-電泳三離子：glycine-Cl-

Protien-glycine-protein-HCl全部解離成Cl-，遷移最快，走在最前“先導(dǎo)離子”甘氨酸僅有0.1～1%解離成Gly-，遷移最慢，走在最后“尾隨離子”重點理解：先導(dǎo)快離子后方離子強度低電導(dǎo)區(qū)電場強度，使glycine和protein加速移動。蛋白樣品受“夾板氣”，被“壓縮”，達“穩(wěn)態(tài)”濃縮膠分離膠甘氨酸大量解離，遷移加快，走在蛋白前，跟著Cl-跑了。樣品蛋白在均一的電場強度和PH中“盡情”泳動根據(jù)樣品成員的分子大小，不同的遷移率，實現(xiàn)分離（分子越小，跑得越快）Cl--glycine-protein-小分子大分子中分子高E低E壓縮,分離效應(yīng)-+濃分pH6.8pH8.8SDSCl-電泳三大致流程提取與處理樣品蛋白電泳分離樣品蛋白轉(zhuǎn)移蛋白至雜交膜封閉非特異性位點一抗孵育洗滌二抗孵育洗滌底物顯色或曝光檢測E鼠兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗鼠Fc段)鼠源一抗HRP大致流程提取與處理樣品蛋白E鼠兔固相載體人源目的蛋白兔源二明確蛋白樣品的來源（組織；細胞；體液）選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥绞剑ㄑ心?；超聲；剪切；凍融等）選擇適當(dāng)?shù)牧呀鈈uffer（SDS；RIPA；NP-40；商品化試劑盒）加入合適的蛋白酶抑制劑（Aprotinin；PMSF；leupeptin;pepstantinA;PIC;EDTA；EGTA）蛋白樣品提取問題蛋白位置推薦buffer全細胞NP-40orRIPA胞漿（可溶性蛋白）Tris-HCl胞漿（骨架結(jié)合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取試劑盒線粒體蛋白RIPAor線粒體分離試劑盒明確蛋白樣品的來源（組織；細胞；體液）蛋白樣品提取問題蛋白位濃縮、純化、脫鹽:①離心；②超濾;③透析;④凍干。變性樣品:SDS：陰離子表面活性劑

①斷開氫鍵；②取消疏水作用；③去除多肽折疊；④屏蔽蛋白電荷量。高溫：①

95~100℃,5~15min（大多數(shù)蛋白）；②70℃,5~10min（多次跨膜蛋白）還原樣品:β-巰基乙醇：強還原劑斷開二硫鍵,破壞二三級結(jié)構(gòu)二硫蘇糖醇(DTT):還原劑斷開二硫鍵,破壞二三級結(jié)構(gòu)蛋白樣品處理問題濃縮、純化、脫鹽:①離心；②超濾;③透析;④凍干。蛋白樣蛋白樣品處理問題待測蛋白狀態(tài)凝膠條件上樣buffer電泳bufferReduced-Denatured還原，變性含β-巰基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native還原，不變性含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不還原，變性不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不還原，不變性不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS根據(jù)目的蛋白的狀態(tài)確定電泳條件：抗體識別蛋白的空間型抗原表位時，不可加熱及SDS變性抗體識別蛋白的氧化狀態(tài)時，就不可加還原劑（β-巰基乙醇或DTT）蛋白樣品處理問題待測蛋白狀態(tài)凝膠條件上樣buffer電泳bu膠類型的選擇：PAGE、SDS、tricine-SDS、IEF、2D膠的濃度選擇：蛋白大小、數(shù)目、個人經(jīng)驗配膠時間：忌即配即用（防凝固不均）；忌長期冰箱放置（防SDS結(jié)晶）；保存≤4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）配膠溫度：室溫或37℃配膠試劑：AP：現(xiàn)用現(xiàn)配或分裝凍存TEMED：最后加,邊加邊晃Tris-HCl:上下膠pH勿混(上6.8/下8.8)丙烯酰胺:神經(jīng)毒性配膠問題蛋白分子量（ku）凝膠濃度（％）4-402010-431512-601220-801025-200857-2125膠類型的選擇：PAGE、SDS、tricine-S蛋白上樣問題上樣的總蛋白量根據(jù)蛋白表達豐度及研究目的調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿浚á?0-70

ug細胞/組織裂解液；②100ng純化蛋白；）上樣的總體積1~30

ul(小板)；1~５0

ul(大板）各孔上樣量一致每孔上樣量盡量保持一致，以防條帶傾斜．上樣孔的選擇忌爛孔（因氧氣進入）、忌不潔孔（多因上膠位置玻璃未洗凈）、忌不齊孔（因上樣孔底部有氣泡、碎膠、未沖孔、不均勻縮膠、不正確拔梳）等蛋白上樣問題上樣的總蛋白量根據(jù)蛋白表達豐度及研究目的調(diào)整適特點PVDF膜NC膜尼龍膜靈敏度和分辨率高高高背景低低較高蛋白結(jié)合能力100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結(jié)合）80-100ug/cm2>400ug/cm2機械強度強干的膜易脆軟而結(jié)實溶劑抗性強差差使用前是否需要浸潤100%甲醇潤濕!!!緩沖液潤濕緩沖液潤濕適用染色方法膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁不能用陰離子染料適用檢測方法顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性適用范圍

普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析普通蛋白WB、氨基酸分析。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用價格高較低低膜的選擇問題特點PVDF膜NC膜尼龍膜靈敏度和分辨率高高高背景低低較高蛋PVDF膜的選擇問題PVDF膜的選擇問題轉(zhuǎn)膜緩沖液問題最好現(xiàn)用現(xiàn)配!轉(zhuǎn)膜緩沖液問題最好現(xiàn)用現(xiàn)配!夾心結(jié)構(gòu)問題夾心結(jié)構(gòu):正—濾、膜、膠、濾—負大?。?/p>

濾紙>=膜>=膠注意事項:①膜用甲醇預(yù)處理②膜隨時保持濕潤（傳統(tǒng)）③盡量使用新濾紙④各層疊放次序正確

⑤不能有氣泡平衡問題：①膜與膠泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中②5~120min(蛋白分子愈小,時間愈短)

纖維墊夾心結(jié)構(gòu)問題夾心結(jié)構(gòu):正—濾、膜、膠、濾—負纖轉(zhuǎn)膜效果問題透視法,考馬斯亮藍染色麗春紅（可逆）酰胺黑CPTS總蛋白染色.麗春紅S染色法：帶負電麗春紅S與帶正電的氨基酸殘基及蛋白的非極性區(qū)結(jié)合,從而形成紅色條帶.

透視法：①干燥PVDF膜后，20%甲醇浸濕；②蛋白區(qū)透明③方便、可逆、蛋白不損、無需染料轉(zhuǎn)膜效果問題透視法,麗春紅S染色法：帶負電麗春紅S與帶正電轉(zhuǎn)膜方式：電泳轉(zhuǎn)移(半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn))虹吸轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜電壓：

10~25V（半干轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)膜電流：1~2mA/cm2，10%gel轉(zhuǎn)膜問題虹吸轉(zhuǎn)移膜濾紙膠-+膜濾紙膠濾紙轉(zhuǎn)膜方式：轉(zhuǎn)膜問題虹膜濾紙膠-+膜濾紙膠濾紙轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量、膠濃度、具體情況決定。檢測多個蛋白時，需進行切膠，分別轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜時間使用0.2μm的PVDF轉(zhuǎn)印膜（PSQ，呈淡藍色）轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)增加甲醇（防止平衡時小分子流失）轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)減少SDS（防止SDS抑制膜與蛋白的結(jié)合）降低凝膠的平衡時間（≤10min）降低電泳轉(zhuǎn)膜時間（＜25min）tricine-SDS小分子蛋白的“流穿”問題使用0.2μm的PVDF轉(zhuǎn)印膜（PSQ，呈淡藍色）小分子蛋白封閉問題定義:

使用含有惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑的緩沖液（PBST/TBST）封閉雜交膜上的非特異性位點舉例:non-fatmilk(脫脂奶粉

BSA（胎牛血清）

casein（酪蛋白）Tween-20（吐溫-20）gelatin(明膠)商業(yè)化的封閉試劑

封閉封閉問題定義:封閉牛E牛兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗牛Fc段)牛源一抗HRP兔E兔源二抗胎牛血清封閉問題注意事項:

抗磷酸化抗體不能用酪蛋白或含磷酸酶的封閉液.

生物素、刀豆蛋白交聯(lián)二抗不用脫脂牛奶同種封閉液的批間差異完全溶解、過濾去除難溶顆粒牛、羊、馬源的一抗盡量不用BSA或脫脂奶粉牛E牛兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗牛Fc段)牛源一抗H

一抗：根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)、種屬選擇合適一抗。注意一抗的種屬，單/多克隆及適用方法等。根據(jù)說明書推薦或預(yù)實驗優(yōu)化最佳稀釋比例。加疊氮鈉，４℃分裝保存，忌反復(fù)凍融。二抗：根據(jù)一抗的來源種屬以及Ig亞型（G、A、M等）選擇合適二抗。選擇合適的標(biāo)記物（HRP、AP、GOD、生物素、熒光素、膠體金）加或不加硫柳汞，４℃分裝保存，忌反復(fù)凍融。根據(jù)說明書推薦或預(yù)實驗（Dotblotting）優(yōu)化最佳稀釋比例。

抗體問題Dotblot一抗：抗體問題Dotblot設(shè)置合適的對照組陽性對照：明確表達目的蛋白，用于檢測抗體的工作效率陰性對照：明確不表達目的蛋白，用于檢測抗體的特異性二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性及stripping效果內(nèi)參對照：檢測實驗體系是否正常工作、進行半定量分析空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的封閉及stripping效果對照問題設(shè)置合適的對照組對照問題內(nèi)參問題內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍beta-actin43kDa胞漿和全細胞GAPDH30-40kDa胞漿和全細胞Tubulin55kDa胞漿和全細胞VCDA1/Porin31kDa線粒體COXIV16kDa線粒體LaminB166kDa細胞核TBP38kDa細胞核根據(jù)內(nèi)參蛋白與目的蛋白的分子大小選擇根據(jù)內(nèi)參蛋白的存在部位確定內(nèi)參不受實驗處理因素影響內(nèi)參問題內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍beta-actin43k適用于檢測兩種分子量接近的蛋白適用于檢測目的蛋白的特定修飾狀態(tài)50℃,150~200rpm,30min(需加β-巰基乙醇)商品化溫和的洗脫液(37℃,60rpm,10~30min)若不換抗體,可不Stripping而直接封閉加抗體檢測；通過二抗對照及空白對照檢測Stripping效果；Stripping問題適用于檢測兩種分子量接近的蛋白Stripping問題無信號(白板)或弱信號(不是白板勝似白板)高背景(黑板、幾盡黑板)非特異性條帶（雜帶）臟帶（操作）、補丁染色表情條帶（微笑、皺眉）鬧鬼（鬼帶、鬼影）

拖尾、紋理、偏斜、過長、過粗條帶其它WB常見問題無信號(白板)或弱信號(不是白板勝似白板)WB常見問題樣品樣品中無目的蛋白或目的蛋白降解

①設(shè)立陽性對照②檢查封閉液是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制劑上樣量不夠或蛋白表達豐度較低①增加上樣量②濃縮純化樣品2.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜不完全①轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色②使用蛋白質(zhì)Marker.洗滌過度減少洗滌時間和次數(shù).3.封閉封閉過度①減少封閉液濃度及封閉時間②更換封閉試劑4.抗體孵育和檢測頭抗體濃度和孵育時間不夠

①增加抗體濃度②延長孵育時間一抗不工作設(shè)置陽性對照二抗不工作和其他一抗配合檢測二抗是否工作一抗/二抗不匹配檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗底物失活或靈敏度低

①重新配制有效的底物②更換高靈敏度底物無信號/弱信號問題(白板)樣品無信號/弱信號問題(白板)1.封閉封閉時間不夠：延長封閉時間優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度封閉液和抗體有交叉反應(yīng)：更換封閉液；加Tween-20減少交叉反應(yīng)磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉液：推薦BSA封閉2.抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度(主要是二抗)孵育溫度太高：建議4度孵育過夜3.其他洗膜不充分：5*3mins，多次短時間的洗膜曝光時間過長：縮短曝光時間出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜二抗非特異性：設(shè)置只加二抗對照背景高問題(黑板)背景高底片曝光1.封閉背景高問題(黑板)背景高底片曝光1.樣品制備二聚體或多聚體：還原變性電泳蛋白不同剪切體或isoforms:實驗論證蛋白降解：①使用新鮮樣品②加蛋白酶抑制劑上樣量過大：減少上樣量2.封閉封閉不充分：優(yōu)化封閉時間和濃度3.抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛冗^高：降低抗體濃度(主要是一抗)抗體沒有經(jīng)過純化:純化或更換抗體二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對照4.其他洗膜保證充分雜帶問題

適當(dāng)稀釋一抗提高特異性適當(dāng)稀釋二抗降低背景二聚體或亞型雜帶目的條帶1.樣品制備雜帶問題適當(dāng)稀釋一抗提高特異性二聚體操作問題操作問題一抗?jié)舛炔粔?增加一抗?jié)舛瓤贵w孵育不均勻:搖床干膜:保持濕潤

細菌污染:①加防腐劑或更換抗體②配制新鮮緩沖液補丁染色問題補丁染色一抗?jié)舛炔粔?增加一抗?jié)舛妊a丁染色問題補丁染色微笑條帶：主要由于凝膠中部聚合不完全，多見于較厚凝膠，也可由于上樣量過大

室溫靜置充分凝固；調(diào)節(jié)上樣量皺眉條帶：凝膠和玻璃擋板底部有氣泡或凝膠兩邊聚合不完全或上樣量過大①在兩板間加入適量緩沖液②完全凝膠③重新配膠④調(diào)整上樣量表情條帶單孔皺眉兩邊皺眉微笑條帶單孔微笑微笑條帶：主要由于凝膠中部聚合不完全，多見于較厚凝膠，也可由拖尾現(xiàn)象：主要是A.樣品融解效果不佳;B.電泳緩沖液時間過長;C.分離膠濃度過大引起①加樣前離心②加適量樣品促溶劑③重配電泳緩沖液④降低凝膠濃度。彌散現(xiàn)象：樣品不溶性顆粒或凝固不充分或制膠問題

①加樣前離心；②加適量樣品促溶劑③充分凝固④重新配膠⑤更換電泳液。

拖尾及彌散條帶拖尾彌散拖尾現(xiàn)象：主要是A.樣品融解效果不佳;拖尾及彌散條帶拖尾彌散

“鬼帶”：A大分子構(gòu)象復(fù)雜蛋白質(zhì)分子未完全變性或輕微復(fù)性；B高含量高純度蛋白存在充分變性還原；C抗體的重輕鏈(①加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；②或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化；③分離或過濾樣品；抗體來源)“鬼影”

(條帶的中心透亮)：上樣量過大、目的蛋白過多適當(dāng)減少上樣量鬼問題鬼影目的條帶鬼帶“鬼帶”：A大分子構(gòu)象復(fù)雜蛋白質(zhì)分子未完全變性或輕微復(fù)性條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜或蛋白上樣不均正確安裝、加樣、上樣均勻條帶兩邊擴散：加樣量過多減少上樣量

偏斜與擴散條帶偏斜條帶擴散條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜或蛋白上樣不均溴酚藍不能起到指示作用(溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象：主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)①更換正確pH值的Buffer；②降低分離膠的濃度。較粗條帶：樣品濃縮不佳或上樣量過大①適當(dāng)增加濃縮膠長度；②保證濃縮膠的pH6.7③適當(dāng)降低電壓④減少上樣量；電泳電壓很高而電流卻很低：電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）d.上樣孔中過多氣泡

①正確裝配電泳槽；②增加電泳液；③以電泳緩沖液趕走氣泡。濃縮膠與分離膠斷裂：①拔梳子用力不均勻或過猛②封閉下膠的水或正丁醇未棄凈

①溫柔拔梳；②棄凈上膠部液體③重新配膠板間氣泡：

a.解除制膠夾后，板未壓緊而致空氣進入;b.解除制膠夾,用力過大

①溫柔并正確操作；②氣泡大時重新配膠其它問題溴酚藍不能起到指示作用(溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下1.Transfertheprotein(dryhydrophobicstate,antibadybinding,eliminateblockingorlengthywashsteps)2.Drythemembrane(wet100%methanolfor5min;dryfor15min)3.1st-antibodyfor1h(1%BSA;1%Tween-20;TBST)4.WashtheblotinTBSTthreetimes,5min/time5.2nd-antibodyfor1h(1%BSA;1%Tween-20;TBST)6.WashtheblotinTBSTthreetimes,5min/time7.AddthesubstrateandexposeindarkplaceAntibodysource;buffercomposition;incubationtimes;PVDFmembrane(RP562)CombinewiththeregularimmunodetectoinArapidimmunodetection1.Transfertheprotein(dryWesternblot實驗技術(shù)

Westernblot實驗技術(shù)Westernblot原理WesternBlot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。Westernblot原理WesternBlot采用的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺凝膠成份分子篩效應(yīng)凝膠濃度，凝膠孔徑↓，機械強度TEMED促使AP形成氧自由基，進而催化Acr單體為長鏈，Bis再使長鏈彼此聯(lián)成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠（PAG）。AP-TEMED系統(tǒng)單體：丙烯酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）催化劑：過硫酸銨（AP）誘發(fā)劑：四甲基乙二胺（TEMED）氧自由基聚丙烯酰胺凝膠注：O2為終止劑分子篩效應(yīng)凝膠濃度，凝膠孔徑↓，機械強度TEMED促使A-+上樣緩沖液（Loadingbuffer）濃縮膠分離膠Tris/HClpH6.8Tris/HClpH8.8[Tris-HClpH6.8;甘油；SDS；巰基乙醇；溴酚藍]

轉(zhuǎn)膜緩沖液（transferbuffer）

[tris-HCl;glycine]電泳緩沖液（runningbuffer）

[tris-HCl;glycine;SDS](Acrylamide;bis;SDS;AP;TEMED)SDS“兩膠三緩沖”sample電泳三離子：glycine-Cl-

Protien-SDS----------------帶負電的蛋白膠束“消除電荷差、構(gòu)像差”-+上樣緩沖液（Loadingbuffer）濃分Tris/-+濃縮膠分離膠pH6.8pH8.8SDSCl-電泳三離子：glycine-Cl-

Protien-glycine-protein-HCl全部解離成Cl-，遷移最快，走在最前“先導(dǎo)離子”甘氨酸僅有0.1～1%解離成Gly-，遷移最慢，走在最后“尾隨離子”重點理解：先導(dǎo)快離子后方離子強度低電導(dǎo)區(qū)電場強度，使glycine和protein加速移動。蛋白樣品受“夾板氣”，被“壓縮”，達“穩(wěn)態(tài)”濃縮膠分離膠甘氨酸大量解離，遷移加快，走在蛋白前，跟著Cl-跑了。樣品蛋白在均一的電場強度和PH中“盡情”泳動根據(jù)樣品成員的分子大小，不同的遷移率，實現(xiàn)分離（分子越小，跑得越快）Cl--glycine-protein-小分子大分子中分子高E低E壓縮,分離效應(yīng)-+濃分pH6.8pH8.8SDSCl-電泳三大致流程提取與處理樣品蛋白電泳分離樣品蛋白轉(zhuǎn)移蛋白至雜交膜封閉非特異性位點一抗孵育洗滌二抗孵育洗滌底物顯色或曝光檢測E鼠兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗鼠Fc段)鼠源一抗HRP大致流程提取與處理樣品蛋白E鼠兔固相載體人源目的蛋白兔源二明確蛋白樣品的來源（組織；細胞；體液）選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥绞剑ㄑ心ィ怀?；剪切；凍融等）選擇適當(dāng)?shù)牧呀鈈uffer（SDS；RIPA；NP-40；商品化試劑盒）加入合適的蛋白酶抑制劑（Aprotinin；PMSF；leupeptin;pepstantinA;PIC;EDTA；EGTA）蛋白樣品提取問題蛋白位置推薦buffer全細胞NP-40orRIPA胞漿（可溶性蛋白）Tris-HCl胞漿（骨架結(jié)合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取試劑盒線粒體蛋白RIPAor線粒體分離試劑盒明確蛋白樣品的來源（組織；細胞；體液）蛋白樣品提取問題蛋白位濃縮、純化、脫鹽:①離心；②超濾;③透析;④凍干。變性樣品:SDS：陰離子表面活性劑

①斷開氫鍵；②取消疏水作用；③去除多肽折疊；④屏蔽蛋白電荷量。高溫：①

95~100℃,5~15min（大多數(shù)蛋白）；②70℃,5~10min（多次跨膜蛋白）還原樣品:β-巰基乙醇：強還原劑斷開二硫鍵,破壞二三級結(jié)構(gòu)二硫蘇糖醇(DTT):還原劑斷開二硫鍵,破壞二三級結(jié)構(gòu)蛋白樣品處理問題濃縮、純化、脫鹽:①離心；②超濾;③透析;④凍干。蛋白樣蛋白樣品處理問題待測蛋白狀態(tài)凝膠條件上樣buffer電泳bufferReduced-Denatured還原，變性含β-巰基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native還原，不變性含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不還原，變性不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不還原，不變性不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS根據(jù)目的蛋白的狀態(tài)確定電泳條件：抗體識別蛋白的空間型抗原表位時，不可加熱及SDS變性抗體識別蛋白的氧化狀態(tài)時，就不可加還原劑（β-巰基乙醇或DTT）蛋白樣品處理問題待測蛋白狀態(tài)凝膠條件上樣buffer電泳bu膠類型的選擇：PAGE、SDS、tricine-SDS、IEF、2D膠的濃度選擇：蛋白大小、數(shù)目、個人經(jīng)驗配膠時間：忌即配即用（防凝固不均）；忌長期冰箱放置（防SDS結(jié)晶）；保存≤4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）配膠溫度：室溫或37℃配膠試劑：AP：現(xiàn)用現(xiàn)配或分裝凍存TEMED：最后加,邊加邊晃Tris-HCl:上下膠pH勿混(上6.8/下8.8)丙烯酰胺:神經(jīng)毒性配膠問題蛋白分子量（ku）凝膠濃度（％）4-402010-431512-601220-801025-200857-2125膠類型的選擇：PAGE、SDS、tricine-S蛋白上樣問題上樣的總蛋白量根據(jù)蛋白表達豐度及研究目的調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿浚á?0-70

ug細胞/組織裂解液；②100ng純化蛋白；）上樣的總體積1~30

ul(小板)；1~５0

ul(大板）各孔上樣量一致每孔上樣量盡量保持一致，以防條帶傾斜．上樣孔的選擇忌爛孔（因氧氣進入）、忌不潔孔（多因上膠位置玻璃未洗凈）、忌不齊孔（因上樣孔底部有氣泡、碎膠、未沖孔、不均勻縮膠、不正確拔梳）等蛋白上樣問題上樣的總蛋白量根據(jù)蛋白表達豐度及研究目的調(diào)整適特點PVDF膜NC膜尼龍膜靈敏度和分辨率高高高背景低低較高蛋白結(jié)合能力100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結(jié)合）80-100ug/cm2>400ug/cm2機械強度強干的膜易脆軟而結(jié)實溶劑抗性強差差使用前是否需要浸潤100%甲醇潤濕!!!緩沖液潤濕緩沖液潤濕適用染色方法膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁不能用陰離子染料適用檢測方法顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性適用范圍

普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析普通蛋白WB、氨基酸分析。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用價格高較低低膜的選擇問題特點PVDF膜NC膜尼龍膜靈敏度和分辨率高高高背景低低較高蛋PVDF膜的選擇問題PVDF膜的選擇問題轉(zhuǎn)膜緩沖液問題最好現(xiàn)用現(xiàn)配!轉(zhuǎn)膜緩沖液問題最好現(xiàn)用現(xiàn)配!夾心結(jié)構(gòu)問題夾心結(jié)構(gòu):正—濾、膜、膠、濾—負大?。?/p>

濾紙>=膜>=膠注意事項:①膜用甲醇預(yù)處理②膜隨時保持濕潤（傳統(tǒng)）③盡量使用新濾紙④各層疊放次序正確

⑤不能有氣泡平衡問題：①膜與膠泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中②5~120min(蛋白分子愈小,時間愈短)

纖維墊夾心結(jié)構(gòu)問題夾心結(jié)構(gòu):正—濾、膜、膠、濾—負纖轉(zhuǎn)膜效果問題透視法,考馬斯亮藍染色麗春紅（可逆）酰胺黑CPTS總蛋白染色.麗春紅S染色法：帶負電麗春紅S與帶正電的氨基酸殘基及蛋白的非極性區(qū)結(jié)合,從而形成紅色條帶.

透視法：①干燥PVDF膜后，20%甲醇浸濕；②蛋白區(qū)透明③方便、可逆、蛋白不損、無需染料轉(zhuǎn)膜效果問題透視法,麗春紅S染色法：帶負電麗春紅S與帶正電轉(zhuǎn)膜方式：電泳轉(zhuǎn)移(半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn))虹吸轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜電壓：

10~25V（半干轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)膜電流：1~2mA/cm2，10%gel轉(zhuǎn)膜問題虹吸轉(zhuǎn)移膜濾紙膠-+膜濾紙膠濾紙轉(zhuǎn)膜方式：轉(zhuǎn)膜問題虹膜濾紙膠-+膜濾紙膠濾紙轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量、膠濃度、具體情況決定。檢測多個蛋白時，需進行切膠，分別轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜時間使用0.2μm的PVDF轉(zhuǎn)印膜（PSQ，呈淡藍色）轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)增加甲醇（防止平衡時小分子流失）轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)減少SDS（防止SDS抑制膜與蛋白的結(jié)合）降低凝膠的平衡時間（≤10min）降低電泳轉(zhuǎn)膜時間（＜25min）tricine-SDS小分子蛋白的“流穿”問題使用0.2μm的PVDF轉(zhuǎn)印膜（PSQ，呈淡藍色）小分子蛋白封閉問題定義:

使用含有惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑的緩沖液（PBST/TBST）封閉雜交膜上的非特異性位點舉例:non-fatmilk(脫脂奶粉

BSA（胎牛血清）

casein（酪蛋白）Tween-20（吐溫-20）gelatin(明膠)商業(yè)化的封閉試劑

封閉封閉問題定義:封閉牛E牛兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗牛Fc段)牛源一抗HRP兔E兔源二抗胎牛血清封閉問題注意事項:

抗磷酸化抗體不能用酪蛋白或含磷酸酶的封閉液.

生物素、刀豆蛋白交聯(lián)二抗不用脫脂牛奶同種封閉液的批間差異完全溶解、過濾去除難溶顆粒牛、羊、馬源的一抗盡量不用BSA或脫脂奶粉牛E牛兔固相載體人源目的蛋白兔源二抗(抗牛Fc段)牛源一抗H

一抗：根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)、種屬選擇合適一抗。注意一抗的種屬，單/多克隆及適用方法等。根據(jù)說明書推薦或預(yù)實驗優(yōu)化最佳稀釋比例。加疊氮鈉，４℃分裝保存，忌反復(fù)凍融。二抗：根據(jù)一抗的來源種屬以及Ig亞型（G、A、M等）選擇合適二抗。選擇合適的標(biāo)記物（HRP、AP、GOD、生物素、熒光素、膠體金）加或不加硫柳汞，４℃分裝保存，忌反復(fù)凍融。根據(jù)說明書推薦或預(yù)實驗（Dotblotting）優(yōu)化最佳稀釋比例。

抗體問題Dotblot一抗：抗體問題Dotblot設(shè)置合適的對照組陽性對照：明確表達目的蛋白，用于檢測抗體的工作效率陰性對照：明確不表達目的蛋白，用于檢測抗體的特異性二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性及stripping效果內(nèi)參對照：檢測實驗體系是否正常工作、進行半定量分析空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的封閉及stripping效果對照問題設(shè)置合適的對照組對照問題內(nèi)參問題內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍beta-actin43kDa胞漿和全細胞GAPDH30-40kDa胞漿和全細胞Tubulin55kDa胞漿和全細胞VCDA1/Porin31kDa線粒體COXIV16kDa線粒體LaminB166kDa細胞核TBP38kDa細胞核根據(jù)內(nèi)參蛋白與目的蛋白的分子大小選擇根據(jù)內(nèi)參蛋白的存在部位確定內(nèi)參不受實驗處理因素影響內(nèi)參問題內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍beta-actin43k適用于檢測兩種分子量接近的蛋白適用于檢測目的蛋白的特定修飾狀態(tài)50℃,150~200rpm,30min(需加β-巰基乙醇)商品化溫和的洗脫液(37℃,60rpm,10~30min)若不換抗體,可不Stripping而直接封閉加抗體檢測；通過二抗對照及空白對照檢測Stripping效果；Stripping問題適用于檢測兩種分子量接近的蛋白Stripping問題無信號(白板)或弱信號(不是白板勝似白板)高背景(黑板、幾盡黑板)非特異性條帶（雜帶）臟帶（操作）、補丁染色表情條帶（微笑、皺眉）鬧鬼（鬼帶、鬼影）

拖尾、紋理、偏斜、過長、過粗條帶其它WB常見問題無信號(白板)或弱信號(不是白板勝似白板)WB常見問題樣品樣品中無目的蛋白或目的蛋白降解

①設(shè)立陽性對照②檢查封閉液是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制劑上樣量不夠或蛋白表達豐度較低①增加上樣量②濃縮純化樣品2.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜不完全①轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色②使用蛋白質(zhì)Marker.洗滌過度減少洗滌時間和次數(shù).3.封閉封閉過度①減少封閉液濃度及封閉時間②更換封閉試劑4.抗體孵育和檢測頭抗體濃度和孵育時間不夠

①增加抗體濃度②延長孵育時間一抗不工作設(shè)置陽性對照二抗不工作和其他一抗配合檢測二抗是否工作一抗/二抗不匹配檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗底物失活或靈敏度低

①重新配制有效的底物②更換高靈敏度底物無信號/弱信號問題(白板)樣品無信號/弱信號問題(白板)1.封閉封閉時間不夠：延長封閉時間優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度封閉液和抗體有交叉反應(yīng)：更換封閉液；加Tween-20減少交叉反應(yīng)磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉液：推薦BSA封閉2.抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度(主要是二抗)孵育溫度太高：建議4度孵育過夜3.其他洗膜不充分：5*3mins，多次短時間的洗膜曝光時間過長：縮短曝光時間出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜二抗非特異性：設(shè)置只加二抗對照背景高問題(黑板)背景高底片曝光1.封閉背景高問題(黑板)背景高底片曝光1.樣品制備二聚體或多聚體：還原變性電泳蛋白不同剪切體或isoforms:實驗論證蛋白降解：①使用新鮮樣品②加蛋白酶抑制劑上樣量過大：減少上樣量2.封閉封閉不充分：優(yōu)化封閉時間和濃度3.抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛冗^高：降低抗體濃度(主要是一抗)抗體沒有經(jīng)過純化:純化或更換抗體二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對照4.其他洗膜保證充分雜帶問題

適當(dāng)稀釋一抗提高特異性適當(dāng)稀釋二抗降低背景二聚體或亞型雜帶目的條帶1.樣品制備雜帶問題適當(dāng)稀釋一抗提高特異性二聚體操作問題操作問題一抗?jié)舛炔粔?增加一抗?jié)舛?/p>