生物化學(xué)DNA的生物合成主講教師：房健生物化學(xué)DNA的生物合成主講教師：房健1本章重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：掌握中心法則；半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄的概念；參與DNA復(fù)制的有關(guān)酶類和蛋白質(zhì)及DNA的復(fù)制過程；DNA損傷修復(fù)的方式。難點(diǎn)：對DNA的半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制的理解；DNA合成的起始與終止。本章重點(diǎn)與難點(diǎn)2遺傳的中心法則1958年Crick提出以DNA為中心的遺傳信息的傳遞規(guī)律，即DNA貯存的遺傳信息通過復(fù)制傳給子代DNA，通過轉(zhuǎn)錄傳給RNA，再通過翻譯傳給蛋白質(zhì)。遺傳信息傳遞方向的這個(gè)規(guī)律被稱為中心法則。DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯反轉(zhuǎn)錄1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)RNA病毒的RNA可通過反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）將遺傳信息傳給cDNA，也可通過RNA復(fù)制或RNA轉(zhuǎn)錄傳給子代RNA，這是對中心法則的補(bǔ)充。1997年瘋牛病和朊病毒的出現(xiàn)，預(yù)示蛋白質(zhì)也可逆向?qū)⑦z傳信息向DNA傳遞。？遺傳的中心法則1958年Crick提出以DN3DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜4復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代（母鏈）DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制(replication)復(fù)制親代DNA子代DNA5一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律（一般原理）BasicRulesofDNAReplication

一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律6復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)復(fù)制的高保真性(highfidelity)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)復(fù)制的方式7（一）DNA復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念（一）DNA復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservati8AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

ATCGATTAATAT+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉9子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式（散布式）子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式全保留式半保10DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度飄移實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：

DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Mesel11密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結(jié)果密度梯度實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-D12按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子13原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從原點(diǎn)(起始點(diǎn)，origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。（二）DNA復(fù)制是固定起點(diǎn)的雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從原點(diǎn)(起始點(diǎn)，origin)向兩個(gè)14第十三章DNA的生物合成課件15A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA16真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰復(fù)制原點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是能夠獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。175’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’18（三）DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)（三）DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′519順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨后鏈或隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段（約1000個(gè)核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragment，1968)。

先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨后鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連續(xù)復(fù)制或復(fù)制的半不連續(xù)性。

順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈或20由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也21（四）需要引物參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。（四）需要引物22二、DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)二、DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)23參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):dAT24（一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

（一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n+dNTP→(d25聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。

新鏈的延長只可沿5→3方向進(jìn)行（模板方向?yàn)?

→5，合成方向?yàn)?→3。）聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板26（二）DNA聚合酶全稱：

DNA依賴的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性（二）DNA聚合酶全稱：DNA依賴的DNA聚合酶(DNA275′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性53外切酶活性?能切除突變的DNA片段和RNA引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性

5′AGCTTCAG28第十三章DNA的生物合成課件291、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ1、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ30催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)+-+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物31功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ（109kD）功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填32DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因33功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ：由十種亞基組成，其中α亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3'→5'外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

(250kD)功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。DNA-po342、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物35真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶36在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長隨從鏈）和polδ（延長領(lǐng)頭鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。

在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA37（三）復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀

復(fù)制的保真性和堿基選擇（三）復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確381、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-po392、復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

2、復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)401.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長時(shí)對堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三41（四）復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（四）復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的421、解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白1、解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白43解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

解螺旋酶(helicase)44單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

單鏈DNA結(jié)合蛋白45解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解螺旋酶。解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或46引發(fā)體(primosome)由引發(fā)前體與引物酶（primase）組裝而成。引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

引發(fā)體(primosome)由引發(fā)前體與引物酶（primas47108局部解鏈后2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

108局部解鏈后2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopo48目錄目錄49拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ分類50拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)51第十三章DNA的生物合成課件52（五）DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式（五）DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈553HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’54DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH55DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。功能56三、DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication三、DNA生物合成過程571、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1）DNA解開成單鏈，提供模板。2）合成引物，提供3-OH末端。（一）原核生物的DNA生物合成

1、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1）DNA解開成單鏈，提供58E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5353a.DNA解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT59DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3535b.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

DnaADnaB、DnaCDNA603535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引61復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。預(yù)引發(fā)：1．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。復(fù)制的起始622．引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。

2．引發(fā)體組裝：63引發(fā)：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

引發(fā)：642、復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

2、復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以65聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的親代DNA鏈為模板，從5'→3'方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領(lǐng)頭鏈）。

聚合子代DNA：66引發(fā)體移動(dòng)：引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，隨從鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。

引發(fā)體移動(dòng)：67第十三章DNA的生物合成課件685'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTP69領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成70隨從鏈的合成隨從鏈的合成71第十三章DNA的生物合成課件72階段一階段二階段一階段二73階段三階段四階段三階段四74復(fù)制過程簡圖復(fù)制過程簡圖75原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV405003、復(fù)制的終止原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(76555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP577第十三章DNA的生物合成課件78去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

去除引物，填補(bǔ)缺口：79連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

連接岡崎片段：80四、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays四、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式81逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)82反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。1970年，Temin和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中發(fā)現(xiàn)發(fā)反轉(zhuǎn)錄酶。致癌RNA病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動(dòng)物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細(xì)胞后并不引起細(xì)胞死亡，卻可以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。經(jīng)過改造后可以作為基因治療的載體。放線菌素D（抑制以DNA為模板的反應(yīng)，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，可見致癌RNA病毒的復(fù)制過程必然涉及DNA。Bader用嘌呤霉素（puromycin）來抑制靜止細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞仍能感染勞氏肉瘤病毒（RSV），證實(shí)反轉(zhuǎn)錄酶是由反轉(zhuǎn)錄病毒帶入細(xì)胞的，而不是感染后在宿主細(xì)胞中新合成的。第十三章DNA的生物合成課件83反轉(zhuǎn)錄酶由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。（1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互補(bǔ)的DNA，形成RNA—DNA雜種分子）。（2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個(gè)方向起外切酶作用。（3）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA以自身病毒類型的RNA為模板時(shí)，該酶的反轉(zhuǎn)錄活力最大，但是帶有適當(dāng)引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二價(jià)陽離子：Mg2+或Mn2+真核mRNA3’端有polyA，加入oligodT后，可以作為反轉(zhuǎn)錄酶的模板，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄酶84逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RN85逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶AAAATTTTAAAASI核酸酶D86（二）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

（二）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研87生物化學(xué)DNA的生物合成主講教師：房健生物化學(xué)DNA的生物合成主講教師：房健88本章重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：掌握中心法則；半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄的概念；參與DNA復(fù)制的有關(guān)酶類和蛋白質(zhì)及DNA的復(fù)制過程；DNA損傷修復(fù)的方式。難點(diǎn)：對DNA的半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制的理解；DNA合成的起始與終止。本章重點(diǎn)與難點(diǎn)89遺傳的中心法則1958年Crick提出以DNA為中心的遺傳信息的傳遞規(guī)律，即DNA貯存的遺傳信息通過復(fù)制傳給子代DNA，通過轉(zhuǎn)錄傳給RNA，再通過翻譯傳給蛋白質(zhì)。遺傳信息傳遞方向的這個(gè)規(guī)律被稱為中心法則。DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯反轉(zhuǎn)錄1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)RNA病毒的RNA可通過反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）將遺傳信息傳給cDNA，也可通過RNA復(fù)制或RNA轉(zhuǎn)錄傳給子代RNA，這是對中心法則的補(bǔ)充。1997年瘋牛病和朊病毒的出現(xiàn)，預(yù)示蛋白質(zhì)也可逆向?qū)⑦z傳信息向DNA傳遞。？遺傳的中心法則1958年Crick提出以DN90DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜91復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代（母鏈）DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制(replication)復(fù)制親代DNA子代DNA92一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律（一般原理）BasicRulesofDNAReplication

一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律93復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)復(fù)制的高保真性(highfidelity)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)復(fù)制的方式94（一）DNA復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念（一）DNA復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservati95AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

ATCGATTAATAT+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉96子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式（散布式）子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式全保留式半保97DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度飄移實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：

DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Mesel98密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結(jié)果密度梯度實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-D99按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子100原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從原點(diǎn)(起始點(diǎn)，origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。（二）DNA復(fù)制是固定起點(diǎn)的雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從原點(diǎn)(起始點(diǎn)，origin)向兩個(gè)101第十三章DNA的生物合成課件102A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)oriterA103真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰復(fù)制原點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是能夠獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。1045’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’105（三）DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)（三）DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5106順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨后鏈或隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段（約1000個(gè)核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragment，1968)。

先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨后鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連續(xù)復(fù)制或復(fù)制的半不連續(xù)性。

順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈或107由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也108（四）需要引物參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。（四）需要引物109二、DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)二、DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)110參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):dAT111（一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

（一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n+dNTP→(d112聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。

新鏈的延長只可沿5→3方向進(jìn)行（模板方向?yàn)?

→5，合成方向?yàn)?→3。）聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板113（二）DNA聚合酶全稱：

DNA依賴的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性（二）DNA聚合酶全稱：DNA依賴的DNA聚合酶(DNA1145′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性53外切酶活性?能切除突變的DNA片段和RNA引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性

5′AGCTTCAG115第十三章DNA的生物合成課件1161、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ1、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ117催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)+-+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物118功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ（109kD）功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填119DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因120功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ：由十種亞基組成，其中α亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3'→5'外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

(250kD)功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。DNA-po1212、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物122真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶123在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長隨從鏈）和polδ（延長領(lǐng)頭鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。

在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA124（三）復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀

復(fù)制的保真性和堿基選擇（三）復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確1251、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-po1262、復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

2、復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)1271.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長時(shí)對堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三128（四）復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（四）復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的1291、解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白1、解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白130解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

解螺旋酶(helicase)131單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

單鏈DNA結(jié)合蛋白132解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解螺旋酶。解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或133引發(fā)體(primosome)由引發(fā)前體與引物酶（primase）組裝而成。引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

引發(fā)體(primosome)由引發(fā)前體與引物酶（primas134108局部解鏈后2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

108局部解鏈后2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopo135目錄目錄136拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ分類137拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)138第十三章DNA的生物合成課件139（五）DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式（五）DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5140HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’141DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH142DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。功能143三、DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication三、DNA生物合成過程1441、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1）DNA解開成單鏈，提供模板。2）合成引物，提供3-OH末端。（一）原核生物的DNA生物合成

1、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1）DNA解開成單鏈，提供145E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5353a.DNA解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT146DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3535b.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

DnaADnaB、DnaCDNA1473535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引148復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。預(yù)引發(fā)：1．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。復(fù)制的起始1492．引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。

2．引發(fā)體組裝：150引發(fā)：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

引發(fā)：1512、復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

2、復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以152聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的親代DNA鏈為模板，從5'→3'方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領(lǐng)頭鏈）