第四章沉淀法(precipitation)第四章沉淀法1生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(沉淀/超過濾/萃取)純化(層析、離子交換、吸附)脫鹽(凝膠過濾、超濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)2第一節(jié)沉淀法概述第二節(jié)鹽析法第三節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法第四節(jié)等電點(diǎn)沉淀法第五節(jié)其他沉淀方法第六節(jié)沉淀法應(yīng)用本章主要內(nèi)容第一節(jié)沉淀法概述本章主要內(nèi)容3一、沉淀法的概念利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。第一節(jié)概述一、沉淀法的概念第一節(jié)概述4二、沉淀法的目的濃縮；有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分，初步純化；將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。二、沉淀法的目的濃縮；5三、沉淀法操作步驟①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；③離心或過濾，收集沉淀物。三、沉淀法操作步驟6四、沉淀生成動力學(xué)溶解度降低是一個(gè)動力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚并作用。通常認(rèn)為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動引起：①熱運(yùn)動，Bromnian運(yùn)動；②對流運(yùn)動，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；③差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。四、沉淀生成動力學(xué)7為了簡化沉淀過程動力學(xué)，可把沉淀過程分成下述６個(gè)步驟：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗運(yùn)動凝集(4)機(jī)械碰撞凝集(5)聚集體陳化(6)聚集體沉淀為了簡化沉淀過程動力學(xué)，可把沉淀過程分成下述６個(gè)步驟：8沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點(diǎn)：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)五、沉淀法的特點(diǎn)沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛9六、沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點(diǎn)沉淀法；（3）有機(jī)溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）復(fù)合鹽沉淀法等（7）親和沉淀法（8）選擇性沉淀法。六、沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：10七、蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中，疏水殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，部分暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。親水殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。七、蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中，疏水殘基具有向內(nèi)部折疊的趨111、蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。1、蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，保122、蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。2、蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子13第二節(jié)鹽析

Saltinducedprecipitation第二節(jié)鹽析

Saltinducedprecipitat14一、鹽析的概念在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。鹽析是可逆的，而變性是不可逆的。一、鹽析的概念在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分15二、鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。二、鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加16中性鹽鹽析法機(jī)理示意圖中性鹽鹽析法機(jī)理示意圖17三、鹽析過程

當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力，蛋白質(zhì)溶解度增大。（2）“鹽析”現(xiàn)象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。三、鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩18第四章-沉淀法課件19鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)四、影響鹽析的因素1、鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強(qiáng)四、影響鹽析的因素1、鹽析用鹽的選擇20在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱。檸檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-NH4+＞K+＞Na+＞高價(jià)陽離子陰離子的影響大于陽離子。在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一21鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。（1）價(jià)廉；（2）溶解度大；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好；（4）不易引起蛋白質(zhì)變性。

缺點(diǎn)：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉缺點(diǎn)：22

由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：

幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它231）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；速度不能太快，分批加入。攪拌需適中。2）加入飽和溶液法用于飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會被稀釋。3）透析平衡法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；24一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。2、鹽濃度對鹽析效果的影響

一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。2、鹽濃度對鹽析25第四章-沉淀法課件26㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;I－離子強(qiáng)度，I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系㏒S=β-ＫsＩCohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系27β和Ks的物理意義β—β代表截距，即當(dāng)離子強(qiáng)度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；Ks與溫度和pH無關(guān)，但和蛋白質(zhì)與鹽的種類有關(guān)。但這種變化不大。β和Ks的物理意義28用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法第一類叫Ks分段鹽析法，在一定pH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定pH，溫度，改變鹽濃度），由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液。第二種叫β分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法第一類叫Ks分段鹽析法，在一定p29鹽析用鹽量的確定-飽和度（Saturation）：以硫酸銨為例：25℃時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時(shí)，溶解度都小于0.1mg/L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。鹽析用鹽量的確定-飽和度（Saturation）：以硫酸銨為30原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達(dá)到S，需加入飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)？X=V×S/(1-S)

X：應(yīng)加入的飽和硫銨溶液的體積V：原蛋白質(zhì)的溶液的體積S：應(yīng)達(dá)到的硫銨飽和度原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達(dá)到S，需加入飽和硫酸銨31原蛋白溶液飽和度為S1，現(xiàn)飽和度增加為S2，需加入多少飽和硫酸銨溶液?X=V×(S2-S1)/(1-S2)X：應(yīng)加入的飽和硫銨體積V：原有溶液的體積S1：原溶液硫銨的飽和度S2：要達(dá)到的硫銨的飽和度原蛋白溶液飽和度為S1，現(xiàn)飽和度增加為S2，需加入多少飽和硫32加固體硫銨的方法加飽和硫銨溶液會使溶液體積增大或使蛋白質(zhì)濃度降低，因此加入固體硫銨比較適合。在20℃時(shí)使1LM1摩爾濃度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至M2摩爾濃度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)C：

C=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

C：需加硫銨的g數(shù) M1：原溶液的濃度摩爾數(shù) M2：需達(dá)到的濃度摩爾數(shù)加固體硫銨的方法加飽和硫銨溶液會使溶液體積增大或使蛋白質(zhì)濃度33在20℃時(shí)使1LS1飽和度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至S2飽和度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)：C=533（S2-S1）/(100-0.3S2)

C：需加硫銨的g數(shù)S1：原溶液的飽和度S2：需達(dá)到的飽和度在20℃時(shí)使1LS1飽和度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至S34以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到

以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到35204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度由于不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，沉淀時(shí)所需的離子強(qiáng)度也不相同，如果需要先除去些雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，則可采用分段鹽析改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。分段鹽析(fractionalsaltingout)204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度由于不36在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽和度達(dá)35％時(shí)，尿素酶基本上仍留在溶液中；而飽和度達(dá)55%時(shí)，尿素酶幾乎全都沉淀出來。在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽和度達(dá)35％時(shí)，尿素酶基373、pH值一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液pH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。3、pH值一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越38在進(jìn)行鹽析時(shí)，必須控制pH圖中直線都相互平行在進(jìn)行鹽析時(shí)，必須控制pH394、溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度隨溫度增加而增加。但在高濃度下，溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。β隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變4、溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度隨溫度增加而405、蛋白質(zhì)濃度沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不固定，而和起始濃度有關(guān)。高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低。分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。5、蛋白質(zhì)濃度沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不固定41起始濃度30g/L的COMb，大部分蛋白質(zhì)在58-65％飽和度沉淀；稀釋10倍的COMb溶液，飽和度達(dá)到66%才開始沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為66-73%飽和度。起始濃度30g/L的COMb，大部分蛋白質(zhì)在58-65％飽和42五、鹽析注意事項(xiàng)選擇適宜飽和度采用分步鹽析鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液加鹽緩慢均勻，攪拌緩慢，以免局部濃度過高，致酶失活。鹽析后最好緩慢攪拌1h，再在冰浴中放置一段時(shí)間。為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。鹽析蛋白盡快脫鹽處理，以免變性，透析慢，用超濾。五、鹽析注意事項(xiàng)選擇適宜飽和度43鹽析注意事項(xiàng)——硫酸銨的使用硫酸銨中含有少量的重金屬離子，對巰基敏感，H2S處理高濃度的硫酸銨呈酸性（pH=5.0左右），用氨水調(diào)pH。硫酸銨容易吸潮，計(jì)算飽和度需注意。固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；鹽析后一般放置0.5-1h后過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。鹽析注意事項(xiàng)——硫酸銨的使用硫酸銨中含有少量的重金屬離子，對44六、鹽析法特點(diǎn)成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡單、安全。不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。

六、鹽析法特點(diǎn)成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。45第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

Isoelectricpointprecipitation第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

Isoelectricpointp46蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，溶液pH值高，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；pH值低，帶正電。當(dāng)溶液的pH值為某一值時(shí)，蛋白質(zhì)幾乎不帶電，即凈電荷為零，這時(shí)的pH值為等電點(diǎn)，常用pI表示。兩性電解質(zhì)在溶液中pH處于等電點(diǎn)pI時(shí)，分子表面靜電荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。一、等電點(diǎn)沉淀的原理蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，溶液pH值高，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；pH值低，47不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。pH=pI不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。pH48第四章-沉淀法課件49①等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(雜質(zhì))也少。是一種常用的分離純化方法。②收率低：等電點(diǎn)附近（處）仍有一定的溶解度，(有時(shí)甚至比較大)，沉淀不完全。等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率。很少單獨(dú)使用，與鹽析，有機(jī)溶劑沉淀等結(jié)合使用。二、等電點(diǎn)沉淀的特點(diǎn)①等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(50③分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)比較接近，容易共沉淀，分辨率較低。主要用于去雜蛋白。最大缺點(diǎn)：無機(jī)酸有引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險(xiǎn)。③分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)比較接近，容易共沉淀，分辨率較51三、等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)(1)生物高分子的等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變化。由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”。陽-高，陰-低。三、等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)52(2)目的物的穩(wěn)定性。有些蛋白質(zhì)或酶在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定。如α-糜蛋白酶(pI=8.1～8.6)，胰蛋白酶(pI=10.1)，它們在中性或偏堿的環(huán)境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。(3)生物大分子在等電點(diǎn)附近鹽溶作用很明顯。單獨(dú)使用或與溶劑沉淀法合用，控制離子強(qiáng)度。(2)目的物的穩(wěn)定性。53第四節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法

organicsoventprecipitation第四節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法

organicsoventpre54在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。一、有機(jī)溶劑沉淀法的概念在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解55許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。pH4.8時(shí)人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙56二、有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易。二、有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)572、缺點(diǎn)1）對生物活性大分子容易引起變性失活；2）操作要求在低溫下進(jìn)行。3）成本高?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。2、缺點(diǎn)58三、有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理

A降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機(jī)<D水）

，減小溶劑極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加帶電粒子間的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B破壞水化膜：使用的有機(jī)溶劑與水互溶，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走水分子，降低蛋白質(zhì)分子的溶劑化能力，破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。C相反力：疏水基團(tuán)暴露并與有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層。三、有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理A降低溶劑介電常數(shù)59有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理降低介電常數(shù)破壞水化膜有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理降低介電常數(shù)60四、常用的有機(jī)溶劑沉析劑1、選擇依據(jù)水溶性要好，一般與水無限混溶。沉淀作用要強(qiáng)，介電常數(shù)要小。致變性作用要小。毒性要小、揮發(fā)性適中。沸點(diǎn)過低有利于除去和回收，但揮發(fā)損失較大，且不安全。給勞動保護(hù)及安全生產(chǎn)帶來麻煩。容易獲取。四、常用的有機(jī)溶劑沉析劑612、常用的有機(jī)溶劑沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀劑。2、常用的有機(jī)溶劑沉淀劑623、有機(jī)溶劑沉淀劑的特點(diǎn)乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析。丙酮：沉析作用大于乙醇，用量小。代替乙醇可減少用量1/4-1/3，但沸點(diǎn)低、揮發(fā)大、著火點(diǎn)低、對肝臟有一定毒性。應(yīng)用范圍不廣。甲醇：沉析作用與乙醇相當(dāng)，對蛋白質(zhì)的變性作用比乙醇和丙酮都小，但口服有強(qiáng)毒，限制了使用。3、有機(jī)溶劑沉淀劑的特點(diǎn)乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒，63不同溶質(zhì)的介電常數(shù)水8020％乙醇7040％乙醇6060％乙醇48100％乙醇242.5mol/L甘氨酸1375mol/L尿素91丙酮22甲醇332.5mol/L甘氨酸的介電常數(shù)很大，可以用作蛋白質(zhì)等生物高分子溶液的穩(wěn)定劑。不同溶質(zhì)的介電常數(shù)水802.5mol/L甘氨酸的介電常64五、溶劑濃度的計(jì)算

V=V0(S2-S1)/(100-S2)

V--需加入的有機(jī)溶劑的體積；Vo--原溶液體積；S1--原溶液中有機(jī)溶劑的濃度；S2--需達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度；該公式未考慮混合后體積的變化，實(shí)際上等體積的乙醇和水相混后體積會縮小5％，如此的體積變化對大多數(shù)工作影響不大，在有精確要求的場合可按摩爾比計(jì)算，這樣可將體積變化因素抵消。五、溶劑濃度的計(jì)算V=V0(S2-S1)/(651、溫度低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有機(jī)溶劑與水混合產(chǎn)熱，體系溫度升高，蛋白質(zhì)變性。因此，務(wù)必要控制在低溫下。低溫提高收率（溫度越低，溶解度越?。Ｓ械那闆r下，把沉淀后清液的溫度降低可沉淀出另一種產(chǎn)品，這就是溫差分級沉淀。六、有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素1、溫度六、有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素66A、預(yù)冷：將溶液和有機(jī)溶劑分別預(yù)冷。后者最好預(yù)冷至-10～-20℃，操作時(shí)應(yīng)不斷攪拌。攪拌一方面是散熱，另一方面防止溶劑局部過濃引起的變性和分辨率下降。溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。B、短時(shí)間的老化處理：為減少溶劑的變性作用，通常使沉淀在低溫下作短時(shí)間的老化處理（0.5-2h）即離心分離，減少有機(jī)溶劑與目的產(chǎn)物的接觸。

控制溫度的具體做法：控制溫度的具體做法：672、pH適宜的pH提高產(chǎn)品的收率和分辨率。許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近有較好的沉淀效果，但不是所有的蛋白質(zhì)，少數(shù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定。注意：使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以致出現(xiàn)較嚴(yán)重的共沉作用。2、pH683、離子強(qiáng)度

較低離子強(qiáng)度有利于沉淀，保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩(wěn)定介質(zhì)pH。離子強(qiáng)度0.01-0.05mol/L，不超過5%。離子強(qiáng)度過高溶劑用量大，沉淀物還夾帶鹽多。3、離子強(qiáng)度694、樣品濃度樣品稀增加溶劑投入量和損耗，降低溶質(zhì)收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果好。濃的樣品增強(qiáng)共沉作用，降低分辨率，減少溶劑用量，但回收率提高，變性的危險(xiǎn)性小。蛋白質(zhì)的初濃度0.5%～2%，粘多糖則1%～2%。4、樣品濃度705、金屬離子助沉作用一些金屬離子如Zn2+，Ca2+等可與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。復(fù)合物的溶解度降低不影響活性，有利于沉淀，降低溶劑耗量。0.005-0.02mol/L的Zn2+可減少溶劑用量l/3-1/2，要避免與金屬離子形成難溶鹽的陰離子的存在(如磷酸根)。5、金屬離子助沉作用71第五節(jié)其他沉淀法在生化制備中經(jīng)常使用的沉淀方法還有成鹽沉淀法、變性沉淀法和共沉淀法。所使用的沉淀劑有金屬鹽、有機(jī)酸類、表面活性劑、離子型或非離子型的多聚物、變性劑或其他一些化合物。第五節(jié)其他沉淀法在生化制備中經(jīng)常使用的沉淀方法還有成鹽沉淀721、概述非離子多聚物20世紀(jì)60年代發(fā)展，最早用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些細(xì)菌與病毒，近年用于核酸和酶的分離純化。聚乙二醇（PEG）、壬苯乙烯化氧（NPEO）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。一、非離子型聚合物1、概述一、非離子型聚合物732、常用的非離子型聚合物——聚乙二醇結(jié)構(gòu)式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH相對分子質(zhì)量從200D到20KDa的的產(chǎn)品都有效。通常使用PEG-6000或PEG-4000。2、常用的非離子型聚合物——聚乙二醇743、PEG沉淀蛋白質(zhì)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、室溫；2、沉淀的顆粒大，產(chǎn)物容易收集；3、非但不使蛋白質(zhì)變性，而且提高穩(wěn)定性。缺點(diǎn)：1、難去除，需用超濾和液－液萃取。2、價(jià)格較昂貴。3、PEG沉淀蛋白質(zhì)的特點(diǎn)75（1）兩種水溶性非離子多聚物組成液-液兩相系統(tǒng)。生物大分子或微粒在兩相系統(tǒng)不等量分配而分離。主要基于不同生物分子和微粒表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)。并外加離子強(qiáng)度，pH值和溫度等因素的影響，增強(qiáng)分離效果。4、非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒的方法（1）兩種水溶性非離子多聚物組成液-液兩相系統(tǒng)。4、非離子多76（2）選用一種水溶性非離子多聚物。生物大分子或微粒在同一液相，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。先離心除去粗大懸浮顆粒，調(diào)整溶液pH值和溫度，加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時(shí)間，即形成沉淀。（2）選用一種水溶性非離子多聚物。77蛋白質(zhì)濃度對用PEG6000沉淀酵母醇脫氫酶時(shí)的影響蛋白質(zhì)濃度對用PEG6000沉淀酵母醇脫氫酶時(shí)的影響78吸附法乙醇沉淀法鹽析法5、沉淀中雜質(zhì)的去除吸附法5、沉淀中雜質(zhì)的去除79吸附法沉淀物溶于磷酸緩沖液用DEAE-纖維素離子交換劑吸附蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)再用KCl洗脫透析脫鹽PEG不被吸附而除去乙醇沉淀法沉淀物溶于磷酸緩沖液用20%乙醇沉淀蛋白質(zhì)離心（PEG留在上清液）

鹽析法沉淀物溶于磷酸緩沖液用35%硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)PEG留在上清液吸附法沉淀物溶于磷酸緩沖液用DEAE-纖維素離子交換劑吸附蛋80二、聚電解質(zhì)沉淀聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團(tuán)的水溶性聚合物?？捎糜诘鞍踪|(zhì)沉淀的聚電解質(zhì)有聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖如肝素等。蛋白質(zhì)分子的相反電荷與聚電解質(zhì)結(jié)合，形成多分子絡(luò)合物發(fā)生沉淀。二、聚電解質(zhì)沉淀聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團(tuán)的水溶性聚合物。81高分子量聚電解質(zhì)沉淀——架橋機(jī)理低分子量聚電解質(zhì)沉淀——電荷中和作用。聚電解質(zhì)過量，導(dǎo)致蛋白質(zhì)重新溶劑化。

高分子量聚電解質(zhì)沉淀——架橋機(jī)理82三、成鹽類復(fù)合物沉淀此類沉析劑有以下三種：（1）高價(jià)金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 與酸性基團(tuán)結(jié)合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、苦酮酸鹽等，與堿性基團(tuán)結(jié)合（3）無機(jī)復(fù)合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等缺點(diǎn)：容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性，需采用較溫和的條件，有時(shí)還需加一定的穩(wěn)定劑。三、成鹽類復(fù)合物沉淀此類沉析劑有以下三種：83１、金屬離子沉淀金屬離子與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位反應(yīng)。例如鋅易與組氨酸殘基中咪唑基結(jié)合，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。Zn2+用于沉淀?xiàng)U菌肽、尿激酶和胰島素。Ca2+（CaCO3）分離乳酸，血清蛋白和檸檬酸。硫酸鋇在檸檬酸生產(chǎn)中去除重金屬。MgSO4用以去除DNA和其他核酸。１、金屬離子沉淀金屬離子與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位反應(yīng)。例如鋅84金屬離子沉淀蛋白質(zhì)①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，如：Ca2+

、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Ｈg2+、Ag+、Pb2+。金屬離子的濃度常為0.02mol/L。去除可用離子交換法或EDTA。金屬離子沉淀蛋白質(zhì)①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化85例：

調(diào)pH4.2上清液胰島素粗品溶液30%丙酮沉淀（雜蛋白）調(diào)pH6.0上清液Zn2+胰島素鋅鹽↓例：862、有機(jī)酸復(fù)合鹽法含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能夠與生物分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但常常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)。應(yīng)用此法應(yīng)采取溫和的條件，有時(shí)加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。2、有機(jī)酸復(fù)合鹽法87（1）丹寧酸（鞣酸）廣泛存在于植物界，其分子結(jié)構(gòu)為5-雙沒食子酸?；咸烟?，為多元酚類化合物。分子上有多個(gè)羧基和羥基。由于蛋白質(zhì)分子中有許多氨基、亞氨基和羧基等，這樣就在蛋白質(zhì)分子與丹寧分子間形成為數(shù)眾多的氫鍵而結(jié)合在一起，從而生成巨大的復(fù)合顆粒沉淀下來。（1）丹寧酸（鞣酸）88第四章-沉淀法課件89丹寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合相對比較牢固。多采用競爭結(jié)合法。即選用比蛋白質(zhì)更強(qiáng)的結(jié)合劑與丹寧結(jié)合，使蛋白質(zhì)游離釋放出來。競爭性結(jié)合劑有乙烯氮戊環(huán)酮(PVP)、聚乙二醇、聚氧化乙烯及山梨糖醇甘油酸酯等。丹寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合相對比較牢固。90（2）雷凡諾(2-乙氧基-6,9-氨基吖啶乳酸鹽)，一種吖啶染料

與蛋白質(zhì)作用主要通過形成鹽的復(fù)合物而沉淀的。此種染料對提純血漿中γ-球蛋白有較好效果。（2）雷凡諾(2-乙氧基-6,9-氨基吖啶乳酸鹽)，一種吖啶91(3)三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)迅速而完全，一般會引起變性。低溫短時(shí)間可使有些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或酶保持活力。此法多用于目的物比較穩(wěn)定且分離雜蛋白相對困難的場合，如分離細(xì)胞色素C工藝。(3)三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)迅速而完全，一般會引起變性92第四章-沉淀法課件933、無機(jī)復(fù)合鹽法如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等，復(fù)合物溶解度很低。常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。若沉淀為金屬復(fù)合鹽，可通以H2S；若為有機(jī)酸鹽、磷鎢酸鹽，則加入無機(jī)酸并用乙醚萃取或用離子交換法除去。3、無機(jī)復(fù)合鹽法94四、親和沉淀

affinityprecipitation

親和沉淀沉淀原理與通常的沉淀有很大的不同。利用蛋白質(zhì)與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)。沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。四、親和沉淀

affinityprecipitatio95第四章-沉淀法課件96蛋白質(zhì)配體載體胰蛋白酶對-氨基苯脒苯甲基聚丙烯酰胺小麥胚芽凝集素N-乙酰半乳糖胺亞單位殼聚糖乳酸脫氫酶汽巴克弄藍(lán)葡聚糖親和沉淀純化蛋白質(zhì)的實(shí)例蛋白質(zhì)配體載體胰蛋白酶對-氨基苯脒苯甲基聚丙烯酰胺小麥胚芽凝97五、選擇性變性沉淀法1、選擇性變性沉淀法的概念選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。五、選擇性變性沉淀法1、選擇性變性沉淀法的概念982、選擇性變性沉淀法的原理利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。2、選擇性變性沉淀法的原理993、選擇性變性沉淀法的方法1）利用表面活性劑或有機(jī)溶劑引起變性；2）利用對熱的不穩(wěn)定性，加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；3）酸堿變性。3、選擇性變性沉淀法的方法1004、選擇性分離核酸酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等，目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振蕩一段時(shí)間、使蛋白質(zhì)在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA、RNA在水溶液中，而蛋白質(zhì)在苯酚層中形成沉淀而被除去；4、選擇性分離核酸酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等，目的是使核酸和101在DNA、RNA混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。硫酸鏈霉素和魚精蛋白沉淀核酸：硫酸鏈霉素和魚精蛋白為多價(jià)陽離子，帶有大量正電荷，可使帶大量負(fù)電荷的核酸發(fā)生直接沉淀。由于成本偏高，加之沉淀后分離較困難，使用不多。在DNA、RNA混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA，而R102從氨基酸混合液中提取特指氨基酸，除采用等電點(diǎn)沉淀、柱層析外還可使用一些特殊的沉淀劑。從豬血纖維水解液中制取組氨酸時(shí)，用氯化汞使其形成汞鹽析出。沉淀通入H2S，組氨酸游離。從酵母酸性提取液分離谷胱甘肽，先生成亞銅鹽沉淀，然后以H2S解析，再用丙酮沉淀。5、氨基酸類沉淀劑從氨基酸混合液中提取特指氨基酸，除采用等電點(diǎn)沉淀、柱層析外還103苯甲醛沉淀精氨酸鄰二甲基苯磺酸沉淀亮氨酸苯偶氮苯磺酸沉淀丙氨酸和絲氨酸2,4-二硝基萘酚-7-磺酸沉淀精氨酸二氨合硫氰化鉻氨沉淀脯氨酸和羥脯氨酸苯甲醛沉淀精氨酸1046、分離粘多糖的沉淀劑

乙醇十六烷基三甲基季胺溴化物(簡稱為CTAB)，十六烷基氯化吡啶（陽離子表面活性劑）6、分離粘多糖的沉淀劑（陽離子表面活性劑）105季胺基與粘多糖形成季胺絡(luò)合物。低離子強(qiáng)度水溶液不溶解，溶液離子強(qiáng)度增加至一定范圍，絡(luò)合物則逐漸解離，最后溶解。此外，CTAB對各種粘多糖的分級沉淀效果與各種粘多糖硫酸化程度和溶液pH值有關(guān)。CTAB的沉淀效力極強(qiáng)，能從很稀的溶液中(如萬分之一濃度)通過選擇性沉淀回收粘多糖。季胺基與粘多糖形成季胺絡(luò)合物。低離子強(qiáng)度水溶液不溶解，溶液離106各種沉淀方法應(yīng)用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。多與其它方法結(jié)合使用。非離子多聚體沉淀法：用于分離生物大分子。生成鹽復(fù)合物沉淀：用于多種物質(zhì)(特別是小分子)選擇性沉淀（熱/酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。各種沉淀方法應(yīng)用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。107第六節(jié)沉淀法應(yīng)用第六節(jié)沉淀法應(yīng)用108沉淀法應(yīng)用酵母醇脫氫酶的分段鹽析尿激酶的沉淀分離沉淀法大規(guī)模提純血漿蛋白胰蛋白酶的提取檸檬酸的提取四環(huán)素的提取生活例子：咸鴨蛋沉淀法應(yīng)用酵母醇脫氫酶的分段鹽析1091、分段鹽析法分離酵母醇脫氫酶過濾液經(jīng)過30%丙酮沉淀雜蛋白后，然后進(jìn)行分段鹽析1、分段鹽析法分離酵母醇脫氫酶過濾液經(jīng)過30%丙酮沉淀雜蛋白110分段鹽析法分離酵母醇脫氫酶丙酮沉淀雜蛋白后粗酶的比活上升4.94倍．分段鹽析中飽和度在50％～55％區(qū)段中析出的組分與粗酶相比其比活上升9.62倍，工藝優(yōu)點(diǎn)：丙酮沉淀雜蛋白后，再加大丙酮濃度使粗酶沉淀的過程,如果不在低溫下逐滴加入冷丙酮，酶活力極易丟失。而鹽析中，硫酸銨的加入會穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使之難于變性,所以在分段鹽析中酶的總活力很少丟失。分段鹽析可以多次重復(fù)進(jìn)行，以便純化倍數(shù)提高。但有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)變性，不易反復(fù)使用。分段鹽析法分離酵母醇脫氫酶丙酮沉淀雜蛋白后粗酶的比活上升4.1112．尿激酶的沉淀分離尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸附法、層析法沉淀法：金屬離子形成復(fù)合鹽脫鹽鹽析2．尿激酶的沉淀分離尿激酶：分離方法包括沉淀法、吸附法、層析112Zn離子沉淀尿激酶低濃度時(shí)，zn能選擇沉淀尿激酶。在3mM可得85-92回收率，而沉淀物的量并不多；加大Zn濃度雖然能提高有限回收率，但沉淀物量大，純度降低。沉淀量酶活Zn離子沉淀尿激酶低濃度時(shí)，zn能選擇沉淀尿激酶。在3m113EDTA溶出效應(yīng)EDTA溶出效應(yīng)114硫酸銨替代EDTA將20g／L硫酸銨(氨水調(diào)pH)按1:4溶出UK尿激酶等電點(diǎn)9.5硫酸銨替代EDTA將20g／L硫酸銨(氨水調(diào)pH)按1:4115硫酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物硫酸銨的選用1)它在低濃度時(shí)可能有鹽溶作用，促進(jìn)沉淀蛋白溶解；2)因?yàn)楸旧碛蠳H4+，與Zn2+有絡(luò)合作用，有利于沉淀物溶解；3)硫酸銨為鹽析所用，在最終鹽析中，只需補(bǔ)加規(guī)定量即可，而不引入其他成分。硫酸銨溶解尿激酶鋅絡(luò)合物硫酸銨的選用116尿激酶鹽析沉淀沉淀量回收率純度尿激酶鹽析沉淀沉淀量回收率117目前國際上通用的血漿蛋白分離方法是采用傳統(tǒng)的低溫乙醇工藝，此工藝經(jīng)多方驗(yàn)證和幾十年的臨床實(shí)踐證明是安全、有效的。利用乙醇的低介電常數(shù)性質(zhì)以及不同蛋白質(zhì)在一定溫度、pH、離子強(qiáng)度及濃度下在不同濃度乙醇中溶解度不同來分離血漿蛋白，生產(chǎn)出多種血漿醫(yī)用蛋白，成為著名的Cohn乙醇沉淀法可將血漿蛋白分離為Ⅰ～Ⅴ個(gè)組分。常利用Ⅰ(纖維蛋白原)、Ⅱ(免疫球蛋白)、Ⅴ(白蛋白)3個(gè)組分。3、利用沉淀法大規(guī)模提純血漿蛋白目前國際上通用的血漿蛋白分離方法是采用傳統(tǒng)的低溫乙醇工藝，此118利用沉淀法提純白蛋白與免疫球蛋白血漿PH6/Pr5%I0.14/T-4/E20%過濾過濾液IV沉淀I+II+III濾液IV沉淀(I+II+III)PH6/Pr2.4%I0.09/T-5/E40%過濾沉淀濾液VPH4.8/Pr1.2%/I0.09T-7/E40%沉淀V(白蛋白)濾液過濾PH5.2/Pr1.0%I0.01/T-4/E14%過濾沉淀濾液PH7.1/Pr0.4%/I0.05T-6/E25%沉淀II(球蛋白)濾液過濾利用沉淀法提純白蛋白與免疫球蛋白血漿PH6/Pr5%I0.1194、胰蛋白酶的提取從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝胰蛋白酶原的溶解：酸性條件下穩(wěn)定溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（pI10.8)濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的進(jìn)一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同4、胰蛋白酶的提取從動物胰臟中提取胰蛋白酶工藝120胰蛋白酶的提?。ǘ┮鹊鞍酌冈せ顬V餅溶解,加入無水CaCl2,邊加邊攪拌,最終含有0.1MCaCl2；5MNaOH調(diào)pH至8.0,加極少量胰酶攪拌，于室溫下活化8～10小時(shí)；活化完成，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5-3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。（一）豬胰蛋白酶原的提取胰臟絞碎加入2倍體積冷乙酸(pH2.5)低溫?cái)嚢?4小時(shí)，過濾；濾液用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時(shí)后，用濾紙過濾；濾液加入硫酸銨,達(dá)0.75飽和度放置過夜抽濾，得酶原粗制品。（三）胰蛋白酶的分離將激活溶液加入固體硫酸銨,達(dá)0.4飽和度,數(shù)小時(shí)后抽濾棄濾餅。濾液加入硫酸銨，飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時(shí)，抽濾棄濾液，即得胰蛋白酶粗品。胰蛋白酶的提?。ǘ┮鹊鞍酌冈せ睿ㄒ唬┴i胰蛋白酶原的提取（1215、檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食品、醫(yī)藥、化工、皮革、環(huán)保等工業(yè)部門都有廣泛的用途。目前檸檬酸極大多數(shù)是通過微生物發(fā)酵法（黑曲霉）生產(chǎn)，提取工藝中，目前大多通過沉淀法制備（碳酸鈣沉淀及硫酸酸解）

CH2—COOHHO—CH2—COOHCH2—COOH5、檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它在食品、醫(yī)藥、化122標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到70度pH1.8~2.0

過濾標(biāo)準(zhǔn)沉淀法回收檸檬酸流程圖加熱到70度pH1.8~2.0過123檸檬酸提取新工藝的主要種類

鈣鹽法因工藝成熟、設(shè)備簡單、原材料易得和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點(diǎn)而在國內(nèi)外被廣泛使用。缺陷：單元操作多，總收率低；消耗化工原料多，固液分離能耗高；環(huán)境污染嚴(yán)重。我國近幾年在非鈣鹽法的提取工藝，取得了實(shí)質(zhì)性突破。已進(jìn)行過中試或生產(chǎn)規(guī)模的技術(shù)有三類：（1）中科院和阜陽檸檬酸廠合作的“工業(yè)離子色譜法”（2）江南大學(xué)的“連續(xù)變溫逆流色譜分離法”；（3）天津科技大學(xué)的“吸附交換分離法”。

檸檬酸提取新工藝的主要種類鈣鹽法因工藝成熟、設(shè)備簡單、原材1246、四環(huán)素的沉淀提取四環(huán)素由鏈絲菌發(fā)酵獲得四環(huán)素等電點(diǎn)pI=5。當(dāng)溶液的pH等于等電點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素易從水溶液中沉淀出來（游離堿），因此可用于四環(huán)素的提取。四環(huán)素又能與尿素形成1：1的復(fù)鹽，從水溶液中沉淀出來，該復(fù)鹽溶于有機(jī)溶劑時(shí)，即分解成四環(huán)素和尿素。四環(huán)素與尿素的這一反應(yīng)具有特異性：金霉素，土霉素都不能與尿素形成復(fù)合物沉淀。利用這一性質(zhì)，可精制四環(huán)素。6、四環(huán)素的沉淀提取四環(huán)素由鏈絲菌發(fā)酵獲得125四環(huán)素發(fā)酵液預(yù)處理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分別加0.2％(w/v)黃血鹽、硫酸鋅過濾濾洗液發(fā)酵液濾渣0.5%草酸水頂洗洗液濾液四環(huán)素發(fā)酵液預(yù)處理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分別加過濾126第一步沉淀提取沉淀粗堿濾液7000-9000u/ml攪拌下慢慢加入濃氨水調(diào)pH4.810-15℃，攪拌30min，過濾第一步沉淀提取沉淀粗堿濾液攪拌下慢慢加入濃氨水調(diào)pH4.8127第二步沉淀提取

溶于尿素鹽酸溶液中（粗堿干重:尿素:水:濃HCl1:2:2:0.25）

粗堿粗堿尿素溶液沉淀四環(huán)素尿素復(fù)鹽丁醇清液丁醇懸浮溶液溶于酸性丁醇中復(fù)鹽干重:丁醇:濃HCl＝1:10:0.3(丁醇先，攪拌下滴加HCl)濾去不溶物

濃氨水調(diào)pH4.6～4.8攪拌20min，過濾結(jié)晶第二步沉淀提取

溶于尿素鹽酸溶液中粗堿粗堿尿素溶液沉淀丁醇1287、討論題：

咸蛋煮熟了，蛋黃里會有油，

這是什么緣故？熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá)31％，為什么看不到一點(diǎn)油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)?？梢钥吹近S色的油滴往外流？7、討論題：

咸蛋煮熟了，蛋黃里會有油，

這是什么緣故？熟鴨129第四章-沉淀法課件130討論題：

咸蛋煮熟了，蛋黃里會有油，

這是什么緣故？蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分散成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來，變成大油液，使得整個(gè)蛋黃變成油滋滋的，甚至流出油來了。討論題：

咸蛋煮熟了，蛋黃里會有油，

這是什么緣故？蛋黃中除131思考題：什么是沉淀法，具體包括哪些方法？理解概念：硫酸銨飽和度，鹽溶，鹽析鹽析的機(jī)理是什么？影響鹽析的因素有哪些？有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理什么？沉淀蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？何為選擇性變性沉淀法？思考題：什么是沉淀法，具體包括哪些方法？132第四章沉淀法(precipitation)第四章沉淀法133生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(沉淀/超過濾/萃取)純化(層析、離子交換、吸附)脫鹽(凝膠過濾、超濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)134第一節(jié)沉淀法概述第二節(jié)鹽析法第三節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法第四節(jié)等電點(diǎn)沉淀法第五節(jié)其他沉淀方法第六節(jié)沉淀法應(yīng)用本章主要內(nèi)容第一節(jié)沉淀法概述本章主要內(nèi)容135一、沉淀法的概念利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。第一節(jié)概述一、沉淀法的概念第一節(jié)概述136二、沉淀法的目的濃縮；有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分，初步純化；將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。二、沉淀法的目的濃縮；137三、沉淀法操作步驟①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長；③離心或過濾，收集沉淀物。三、沉淀法操作步驟138四、沉淀生成動力學(xué)溶解度降低是一個(gè)動力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚并作用。通常認(rèn)為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動引起：①熱運(yùn)動，Bromnian運(yùn)動；②對流運(yùn)動，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；③差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。四、沉淀生成動力學(xué)139為了簡化沉淀過程動力學(xué)，可把沉淀過程分成下述６個(gè)步驟：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗運(yùn)動凝集(4)機(jī)械碰撞凝集(5)聚集體陳化(6)聚集體沉淀為了簡化沉淀過程動力學(xué)，可把沉淀過程分成下述６個(gè)步驟：140沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛用于生產(chǎn)，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點(diǎn)：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)五、沉淀法的特點(diǎn)沉淀法不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，因其不需專門設(shè)備，且易于放大，也廣泛141六、沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點(diǎn)沉淀法；（3）有機(jī)溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）復(fù)合鹽沉淀法等（7）親和沉淀法（8）選擇性沉淀法。六、沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：142七、蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中，疏水殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，部分暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。親水殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。七、蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中，疏水殘基具有向內(nèi)部折疊的趨1431、蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。1、蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，保1442、蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。2、蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子145第二節(jié)鹽析

Saltinducedprecipitation第二節(jié)鹽析

Saltinducedprecipitat146一、鹽析的概念在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。鹽析是可逆的，而變性是不可逆的。一、鹽析的概念在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分147二、鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。二、鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加148中性鹽鹽析法機(jī)理示意圖中性鹽鹽析法機(jī)理示意圖149三、鹽析過程

當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力，蛋白質(zhì)溶解度增大。（2）“鹽析”現(xiàn)象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。三、鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩150第四章-沉淀法課件151鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)四、影響鹽析的因素1、鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強(qiáng)四、影響鹽析的因素1、鹽析用鹽的選擇152在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱。檸檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-NH4+＞K+＞Na+＞高價(jià)陽離子陰離子的影響大于陽離子。在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一153鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。（1）價(jià)廉；（2）溶解度大；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好；（4）不易引起蛋白質(zhì)變性。

缺點(diǎn)：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉缺點(diǎn)：154

由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：

幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它1551）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；速度不能太快，分批加入。攪拌需適中。2）加入飽和溶液法用于飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；可防止局部過濃，但加量較多時(shí)，料液會被稀釋。3）透析平衡法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；156一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。2、鹽濃度對鹽析效果的影響

一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。2、鹽濃度對鹽析157第四章-沉淀法課件158㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;I－離子強(qiáng)度，I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系㏒S=β-ＫsＩCohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系159β和Ks的物理意義β—β代表截距，即當(dāng)離子強(qiáng)度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；Ks與溫度和pH無關(guān)，但和蛋白質(zhì)與鹽的種類有關(guān)。但這種變化不大。β和Ks的物理意義160用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法第一類叫Ks分段鹽析法，在一定pH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定pH，溫度，改變鹽濃度），由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液。第二種叫β分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法第一類叫Ks分段鹽析法，在一定p161鹽析用鹽量的確定-飽和度（Saturation）：以硫酸銨為例：25℃時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到85%飽和度時(shí)，溶解度都小于0.1mg/L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。鹽析用鹽量的確定-飽和度（Saturation）：以硫酸銨為162原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達(dá)到S，需加入飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)？X=V×S/(1-S)

X：應(yīng)加入的飽和硫銨溶液的體積V：原蛋白質(zhì)的溶液的體積S：應(yīng)達(dá)到的硫銨飽和度原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達(dá)到S，需加入飽和硫酸銨163原蛋白溶液飽和度為S1，現(xiàn)飽和度增加為S2，需加入多少飽和硫酸銨溶液?X=V×(S2-S1)/(1-S2)X：應(yīng)加入的飽和硫銨體積V：原有溶液的體積S1：原溶液硫銨的飽和度S2：要達(dá)到的硫銨的飽和度原蛋白溶液飽和度為S1，現(xiàn)飽和度增加為S2，需加入多少飽和硫164加固體硫銨的方法加飽和硫銨溶液會使溶液體積增大或使蛋白質(zhì)濃度降低，因此加入固體硫銨比較適合。在20℃時(shí)使1LM1摩爾濃度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至M2摩爾濃度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)C：

C=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

C：需加硫銨的g數(shù) M1：原溶液的濃度摩爾數(shù) M2：需達(dá)到的濃度摩爾數(shù)加固體硫銨的方法加飽和硫銨溶液會使溶液體積增大或使蛋白質(zhì)濃度165在20℃時(shí)使1LS1飽和度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至S2飽和度，所需加入（NH4）2SO4的克數(shù)：C=533（S2-S1）/(100-0.3S2)

C：需加硫銨的g數(shù)S1：原溶液的飽和度S2：需達(dá)到的飽和度在20℃時(shí)使1LS1飽和度時(shí)（NH4）2SO4溶液增至S166以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到

以上數(shù)據(jù)都可在有關(guān)書上查到167204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度由于不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，沉淀時(shí)所需的離子強(qiáng)度也不相同，如果需要先除去些雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，則可采用分段鹽析改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。分段鹽析(fractionalsaltingout)204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度由于不168在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽和度達(dá)35％時(shí)，尿素酶基本上仍留在溶液中；而飽和度達(dá)55%時(shí)，尿素酶幾乎全都沉淀出來。在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽和度達(dá)35％時(shí)，尿素酶基1693、pH值一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液pH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。3、pH值一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越170在進(jìn)行鹽析時(shí)，必須控制pH圖中直線都相互平行在進(jìn)行鹽析時(shí)，必須控制pH1714、溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度隨溫度增加而增加。但在高濃度下，溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。β隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變4、溫度的影響在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度隨溫度增加而1725、蛋白質(zhì)濃度沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不固定，而和起始濃度有關(guān)。高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低。分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。5、蛋白質(zhì)濃度沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不固定173起始濃度30g/L的COMb，大部分蛋白質(zhì)在58-65％飽和度沉淀；稀釋10倍的COMb溶液，飽和度達(dá)到66%才開始沉淀，而相應(yīng)的沉淀范圍為66-73%飽和度。起始濃度30g/L的COMb，大部分蛋白質(zhì)在58-65％飽和174五、鹽析注意事項(xiàng)選擇適宜飽和度采用分步鹽析鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液加鹽緩慢均勻，攪拌緩慢，以免局部濃度過高，致酶失活。鹽析后最好緩慢攪拌1h，再在冰浴中放置一段時(shí)間。為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。鹽析蛋白盡快脫鹽處理，以免變性，透析慢，用超濾。五、鹽析注意事項(xiàng)選擇適宜飽和度175鹽析注意事項(xiàng)——硫酸銨的使用硫酸銨中含有少量的重金屬離子，對巰基敏感，H2S處理高濃度的硫酸銨呈酸性（pH=5.0左右），用氨水調(diào)pH。硫酸銨容易吸潮，計(jì)算飽和度需注意。固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；鹽析后一般放置0.5-1h后過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。鹽析注意事項(xiàng)——硫酸銨的使用硫酸銨中含有少量的重金屬離子，對176六、鹽析法特點(diǎn)成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡單、安全。不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。

六、鹽析法特點(diǎn)成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。177第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

Isoelectricpointprecipitation第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

Isoelectricpointp178蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，溶液pH值高，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；pH值低，帶正電。當(dāng)溶液的pH值為某一值時(shí)，蛋白質(zhì)幾乎不帶電，即凈電荷為零，這時(shí)的pH值為等電點(diǎn)，常用pI表示。兩性電解質(zhì)在溶液中pH處于等電點(diǎn)pI時(shí)，分子表面靜電荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低并沉淀析出。一、等電點(diǎn)沉淀的原理蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，溶液pH值高，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；pH值低，179不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。pH=pI不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。pH180第四章-沉淀法課件181①等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(雜質(zhì))也少。是一種常用的分離純化方法。②收率低：等電點(diǎn)附近（處）仍有一定的溶解度，(有時(shí)甚至比較大)，沉淀不完全。等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率。很少單獨(dú)使用，與鹽析，有機(jī)溶劑沉淀等結(jié)合使用。二、等電點(diǎn)沉淀的特點(diǎn)①等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(182③分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)比較接近，容易共沉淀，分辨率較低。主要用于去雜蛋白。最大缺點(diǎn)：無機(jī)酸有引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險(xiǎn)。③分辨率較低：許多分子的等電點(diǎn)比較接近，容易共沉淀，分辨率較183三、等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)(1)生物高分子的等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變化。由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”。陽-高，陰-低。三、等電點(diǎn)沉淀注意事項(xiàng)184(2)目的物的穩(wěn)定性。有些蛋白質(zhì)或酶在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定。如α-糜蛋白酶(pI=8.1～8.6)，胰蛋白酶(pI=10.1)，它們在中性或偏堿的環(huán)境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。(3)生物大分子在等電點(diǎn)附近鹽溶作用很明顯。單獨(dú)使用或與溶劑沉淀法合用，控制離子強(qiáng)度。(2)目的物的穩(wěn)定性。185第四節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法

organicsoventprecipitation第四節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法

organicsoventpre186在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。一、有機(jī)溶劑沉淀法的概念在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解187許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。pH4.8時(shí)人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙188二、有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易。二、有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)1、優(yōu)點(diǎn)1892、缺點(diǎn)1）對生物活性大分子容易引起變性失活；2）操作要求在低溫下進(jìn)行。3）成本高?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。2、缺點(diǎn)190三、有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理

A降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機(jī)<D水）

，減小溶劑極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加帶電粒子間的