一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分1906年俄國植物學家Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分1906年俄國植物12高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結構色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產生原理高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱2高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結構高壓泵進樣器檢21Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色譜分離基本原理PartitioncoefficientK分配系數(shù)1Basicprincipleofchromatog3硅膠顆?；|合成步驟：1.合成硅膠基質2.鍵合配體(鍵合相)3.端基封尾end-capped硅膠顆?；|合成步驟：4以傳統(tǒng)方式制造硅膠色譜填料的過程:

起始原料為礦物硅酸鹽（如泡花堿），即A類硅膠90年代以后方式：organosilicapolymer有機單晶硅聚合的硅膠，即B類硅膠以傳統(tǒng)方式制造硅膠色譜填料的過程:

起始原料為礦物硅酸鹽（5色譜柱分類與選擇-內部培訓講義資料課件6填料的端基封尾–封口殘余硅羥基–減少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）C18鍵合并端基封尾后還能看見什么？硅羥基!—即使進行高密度鍵合，硅膠表面仍將殘留約50%硅羥基(SiOH)!填料的端基封尾C18鍵合并端基封尾后7單、雙、三官能團鍵合三官能團鍵合二官能團鍵合單官能團鍵合單、雙、三官能團鍵合三官能團鍵合二官能團鍵合單官能團鍵合8鍵合鍵合9常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷極性封尾，增加極性保留HypersilODS即沒有封尾HypersilODS-2有封尾由于空間位阻的存在，鍵合反應最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團會發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三甲基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，封端，封口。封尾常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷極性封尾，增加極10封尾封尾11空間位阻：異丙基硅氧烷，異丁基硅氧烷空間位阻：異丙基硅氧烷，異丁基硅氧烷12空間位阻空間位阻13極性嵌入polarembedded極性嵌入polarembedded14問題：下列色譜柱如何選擇？amidohexadecylsilylsilicagelColumn:

—size:l=0.25m,?=4.6mm;

—stationaryphase:diisopropylcyanopropylsilylsilica

gelforchromatographyR(5μm)withaspecific

surfaceareaof180m2/gandaporesizeof8nm;—stationaryphase:sphericaloctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm)withaspecificsurfaceareaof170m2/gandaporesizeof12nm.—stationaryphase:aminopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),—stationaryphase:end-cappedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),—stationaryphase:base-deactivatedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(3μm).—stationaryphase:octylsilylbase-deactivatedsilicagelforchromatographyR(4μm)withaporesizeof6nm,—stationaryphase:end-cappedpolar-embeddedoctadecylsilylamorphousorganosilicapolymerR(5μm);MobilephaseMix35volumesofacetonitrileRand65volumesofa5.23g/lsolutionofdipotassiumhydrogenphosphateRpreviouslyadjustedtopH7.0withphosphoricacidR.

（答案見備注信息）問題：下列色譜柱如何選擇？amidohexadecylsil15以傳統(tǒng)方式制造硅膠（A類硅膠）色譜填料的過程:

起始原料為礦物硅酸鹽（如泡花堿）Na2SiO3(礦物)+2H+Si(OH)4(silicicacid)+2Na+硅膠顆粒(含金屬雜質!)C18/C8bonding+endcappingC18/C8ReversedPhases(最終仍帶金屬雜質!)以傳統(tǒng)方式制造硅膠（A類硅膠）色譜填料的過程:

起始原料為16

與鍵合相的疏水性作用雙重保留機理:1).與鍵合相的的疏水性作用;2).與殘余硅醇基間的離子交換作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+當流動相pH值小于3時,硅醇基呈中性(未解離)

BaseBase對堿性化合物的保留及嚴重拖尾兩實驗使用相同的傳統(tǒng)C8硅膠柱離子交換作用堿性分析物在硅膠柱上的拖尾機理當流動相為pH6-8時,硅醇基帶負電性(大部解離)與鍵合相的疏水性作用雙重保留機理:1).與鍵合相的的疏水17既然pH<3時硅醇基離解受抑制，為何不在所有情況下采用酸性條件進行分離?低pH可導致分離選擇性的完全喪失!pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline既然pH<3時硅醇基離解受抑制，為何不在所有情況下采用酸性18硅膠晶格中雜質鋁對硅醇基酸度的影響質子酸H金屬嵌入硅膠晶格中，使硅醇基的酸性大大增強+_硅膠晶格中雜質鋁對硅醇基酸度的影響質子酸H金屬嵌入硅膠晶格中19硅膠中金屬雜質含量對螯合性化合物Hinokitiol峰形的影響Minutes2468流動相:20mMPhosphateBufferpH3.6（含0.05%EDTA):Acetonitrile(50:50)低金屬雜質高金屬雜質含量硅膠中金屬雜質含量對螯合性化合物Hinokitiol峰形的影20

金屬雜質的存在可使得硅醇基過度活化，以至某些堿性化合物在酸性條件下仍呈現(xiàn)拖尾峰

分析物:Chlorpheniramine雜質鋁含量,ppm12340100200300400拖尾因子

“高純硅膠”區(qū)流動相

:乙腈/KH2PO4pH3.0(20:80)金屬雜質的存在可使得硅醇基過度活化，以至某些堿性化合21傳統(tǒng)型C18硅膠柱上金屬雜質對堿性化合物峰形的影響Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene鋁雜質含量~375ppmTfUSP=6.5

流動相pH7傳統(tǒng)型C18硅膠柱上金屬雜質對堿性化合物峰形的影響Minut22如何解決堿性化合物和螯合物的峰形問題?從修飾流動相著手改善峰形(例如使用競爭性堿TEA或離子對色譜)1970-1980年代策略從改善反相填料著手降低硅醇基活性自1990年代起至今如何解決堿性化合物和螯合物的峰形問題?從修飾流動相著手改善峰23現(xiàn)代色譜柱三大技術平臺親水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高極性化合物保留寬pH色譜柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxODS-Extend目的：提高色譜柱pH使用范圍純硅膠柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18極性嵌入柱ECOSILODS-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形現(xiàn)代色譜柱三大技術平臺親水AQ柱寬pH色譜柱純硅膠柱24Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)B類超純硅膠柱基體顆粒的化學合成過程無金屬雜質的超純起始原料TetraethoxysilanePolyethoxysil25常見品牌C18柱在pH7下的性能比較品牌Acenaphk'Amitrip/AcenapaAmitriptyline拖尾因子(美國藥典法)EcosilC18-SH161.31.4InertsilODS-2161.42.5PuresilC18141.53.3ZorbaxRxC18161.86.0PurospherRP-18164.86.0KromasilC18AlltimaC1819231.53.5

9.413Nova-PakC18162.35.5NucleosilC18154.3

10HypersilODS112.8

10ZorbaxODS21無法測得結果!常見品牌C18柱在pH7下的性能比較品牌Acenaphk'A262.6常見品牌C18柱在pH3下的性能比較柱品牌Toluamidek'Chlorph/ToluamaChlorpheniramineECOSILC18SHPurospherRP181.40.711.4AlltimaCInertsilODS-ZorbaxRxCPuresilCNova-PakC181.33.9NucleosilCZorbaxODSHypersilODS1.511

11KromasilC18

1.5

3.61.8拖尾因子(美國藥典法)2.6常見品牌C18柱在pH3下的性能比較柱品牌Toluam27對堿性化合物的峰對稱性

pH7

pH3

Symmetry

Symmetry(極佳)

Inertsil

Purospher

LiChrospherRPselectB

Alltima

YMCbasic

Inertsil

Puresil

kromasil

Purospher

YMCbasic

ZorbaxRx

ZorbaxRx

Nova-Pak

LiChrospherRPselectB

kromasil

Puresil

Alltima

Nova-Pak

Nucleosil

Nucleosil

Hypersil

Zorbax

Zorbax

Hypersil

(差)

常見品牌柱在pH3和pH7下的峰形優(yōu)劣排序EcosilODS-SHEcosilODS-SH對堿性化合物的峰對稱性pH7pH3Symmet28具有極性嵌入基團的反相填料結構示意

OSiCH3CH3極性基團極性嵌入基團鍵合配體OSiCH3CH3傳統(tǒng)直鏈型烷基鍵合配體具有極性嵌入基團的反相填料結構示意OSiCH3CH3極性極29內嵌極性基團固定相：水表面層可能機理水“屏蔽”層改善與水的浸潤性－100%水溶液兼容降低了堿性化合物的保留降低了拖尾現(xiàn)象屏蔽了帶負電的硅羥基極性基團增加了表面層水的濃度內嵌極性基團固定相：水表面層可能機理水“屏蔽”層改善與水的3001020304050用于浸潤固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在1mL/min流速下的浸潤率%C18鍵合相硅膠柱填料需要合適的濕潤度注意：需要有機溶劑來保證反相填料有合適的濕度,反之停流速后易出現(xiàn)“疏水塌陷”問題01020304050用于浸潤固定相的甲醇水溶液的比例%0231未濕潤的孔濕潤的孔注意：保留時間與填料表面積與配體有關。然而，如果硅膠表面未濕潤，那么有效的色譜表面積會減少95%，因此，減少被分析物的保留時間即等于“疏水塌陷”，記?。簬缀跛械谋砻娣e都在孔內！低比例有機溶劑或純水溶液流動相C18

硅膠什么是“疏水塌陷”？未濕潤的孔濕潤的孔注意：保留時間與填料表面積與配體有關。然而32分0246810流動相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒有保留“濕潤時”“去濕后”疏水塌陷分0246810流動相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被33停流速后(孔去濕:~3%)流動相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始時保留時間無變化阿莫西林極性嵌入色譜柱：無疏水塌陷現(xiàn)象發(fā)生內嵌極性基團鍵合相：使用高比例水溶液流動相時色譜性能穩(wěn)定停流速后(孔去濕:~3%)流動相：0.1%醋酸水溶液M34EcosilC18-EPSTfUSP=1.1分0102030阿米替林EcosilC18-SHTfUSP=1.4注意：對堿性化合物而言，可以減少保留時間并且改善色譜峰形相同硅膠基質(配體不同)內嵌極性基團的配體與直鏈烷烴配體的比較EcosilC18-EPS分0102030阿米替林Ecos35注:使用相同的流動相EcosilC8-EPSEcosilC8-SH選擇性不同呋喃唑酮(痢特靈)雜質分析注:使用相同的流動相EcosilC8-EPSEcosil36極性基團嵌入技術（屏蔽技術）的歷史沿革1990:Supelcosil?pKb-100(嵌入酰胺鍵),專利(兩步合成法)1992:Prism?RP(嵌入脲結構)和Supelcosil?LC-ABZ(兩步合成法)1993:Supelcosil?ABZ+Plus(兩步合成法)1995/1996:WatersSymmetryShield?RP18/RP8(氨基甲酸酯結構),專利(一步合成法)1999:WatersXterra?RP18/RP8(氨基甲酸酯結構),專利(一步合成法)1998/1999(Supelco放棄了基于酰胺鍵嵌入技術的兩步合成法專利):Discovery?RPAmideC16(一步合成法)許多其他公司開始仿制.2000:ECOSILC18-EPS/C8-EPS(酰胺基十六烷基結構)(一步合成法)極性基團嵌入技術（屏蔽技術）的歷史沿革1990:Supel37多種品牌色譜柱對堿性化合物的峰形比較USPTailingFactor(amitriptyline,pH7)3.44.355.66.491013579EcosilC8-EPSEcosilC18-EPSSymmetryShield?RP8SymmetryShield?RP18YMC-Pack?PolymericC18?Luna?C18(2)Supelcosil?ABZ+PlusDiscovery?RPAmideC16ECOSILC18SHLuna?C18Zorbax?BonusRPYMC-Pack?CNNova-Pak?CNHPYMC-Pack?ProC8?Symmetry?C18Symmetry?C8YMC-Pack?ProC18?Nova-Pak?PhenylZorbax?ExtendC18YMC-Pack?PhenylYMC-Pack?ODS-AWatersSpherisorb?ODSBNova-Pak?C18WatersSpherisorb?ODS2μBondapak?C18多種品牌色譜柱對堿性化合物的峰形比較USPTailing38Atlantis?

dC18Column:

揭開人類釀酒歷史之謎(2004)

古埃及十二世王Tutankhamen(約公元前1346-1327)1922年發(fā)掘Tut王墓葬時所發(fā)現(xiàn)的具象形文字的殘片,疑為盛酒器皿上的標簽說明TartaricAcid(酒石酸)

SyringicAcid(丁香酸):是紅葡萄中的兩個內源性標記物Atlantis?dC18Column:

揭開人類釀酒歷39AQ柱的極性保留秘訣表面峰端鍵合密度鍵合相連接方式微孔大小防微孔脫水峰形保留性能柱壽命1、極性封尾2、極性嵌入3、低碳載量4、保留硅羥基5、增加極性嵌入鍵合相AQ柱的極性保留秘訣表面峰端鍵合密度鍵合相連接方式微孔大小防AQ色譜柱的特點對極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性在100％水溶液流動相中運行保持色譜性能穩(wěn)定峰形優(yōu)異超低鍵合相流失，質譜兼容酸性條件下穩(wěn)定性良好在高水相、低pH條件下具有較長的色譜柱壽命極佳的色譜柱間重現(xiàn)性AQ色譜柱的特點對極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性41AtlantisadC18柱對極性化合物的優(yōu)異保留性能對嘌呤堿表現(xiàn)良好峰形(因對填料進行了徹底封端)Compounds:

1.Cytosine2.5-Fluorocytosine3.Uracil4.5-Fluorouracil5.Guanine6.Thymine7.Adenine123456Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.007V0=1.83minConditionsColumn:AtlantisTMdC184.6x150mm,5μmMobilePhaseA:H20MobilePhaseB:ACNMobilePhaseC:100mMCH3COONH4,pH5.0FlowRate:1.0mL/minGradient: Time Profile (min) %A%B %C 0.0 900 10 10.0 846 10InjectionVolume:10μLTemperature:30oCDetection:UV@254nmInstrument::AllianceTM2695,2996PDA尿嘧啶(Uracil)

是測試反相柱最廣泛采用的死體積標記物,但在AtlantisadC18柱上具顯著保留AtlantisadC18柱對極性化合物的優(yōu)異保留性能對嘌42AtlantisdC18:丙毒(丙烯酰胺)分析色譜柱：AtlantisdC18色譜柱5μm，2.1×150mm流動相：0.1%甲酸+甲醇=98+2流速：0.2mL/min進樣體積：20ml數(shù)據(jù)來源：北京CDCAtlantisdC18:丙毒(丙烯酰胺)分析色譜柱：At43條件色譜柱：AtlantisTMdC184.6x150mm,5μm流動相A:0.1%TFA水溶液流動相B:0.1%TFA乙腈溶液流速:1.4mL/min梯度: 時間 梯度組成 (min) %A%B 0.0 1000 5.0 973 6.0 8515 10.0 8020 12.0 0100 25.0 0100進樣體積:10.0μL溫度:30oC檢測:UV@268nm儀器:AllianceTM2695,2996PDA極性與非極性化合物保留的完美平衡化合物：

濃度(μg/mL)1.L-抗壞血酸(VC) 19.62.煙酸(niacin) 9.83.硫胺(VB1) 19.64.吡哆醛 39.25.吡哆醇(VB6) 39.26.葉酸(VB11) 23.57.咖啡因 9.88.核黃素(VB2) 3.99.視黃醇(VA) 19.610.生育酚(VE) 39.211.麥角鈣化甾醇(VD2) 9.8Grumbach,DiehlMinutes2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0012345876V0=1.37min10911對于水溶性維生素的極佳保留對于脂溶性維生素不過度保留注：無需離子對試劑！條件極性與非極性化合物保留的完美平衡化合物： 濃度(μg44問題AQ柱有哪些不足之處？？問題AQ柱有哪些不足之處？？45HILICHydrophilicInteractionLiquidChromatography(HILIC)親水作用液相色譜

其他HILC柱硅膠柱氨基柱丙基酰胺柱親水鍵合硅膠柱（多羥基等）問題：為什么不考慮SCX或SAXHILICHydrophilicInteractionLHILIC柱特性HILIC柱用于在AQ柱上依然無有效保留的場合分離機制為“反反相色譜”技術HILIC柱與C18柱上的出峰順序剛好相反由于使用含高有機溶劑成分的流動相進行分離，在LC/MS應用中的檢測靈敏度比AQ柱上顯著提高可直接將樣品溶于純有機溶劑中進樣，省卻了將樣品溶劑蒸干再定容的麻煩。HILIC保留特性1、固定水，利用氫鍵作用2、離子交換作用洗脫能力：water>methanol>ethanol>propanol>

acetonitrile

>acetoneHILIC柱特性HILIC柱用于在AQ柱上依然無有效保留的三聚氰胺和三聚氰酸同時檢測FDA推薦Zic-HILIC三聚氰胺和三聚氰酸同時檢測FDA推薦Zic-HILIC色譜柱分類與選擇-內部培訓講義資料課件49突破高純硅膠柱局限性的必要性硅膠柱pH適用極限0102030400123456789101112kpH硅醇基解離,帶負電荷硅醇基未解離堿性化合物具良好峰形但保留不足對堿性化合物的保留增強,但需嚴格控制流動相pH值。封端不佳的反相柱會面臨峰拖尾的問題。pH10NortriptylineAmitriptylineMinutes0123Minutes0123pH2硅醇基完全解離,硅膠基體逐步溶解！堿性化合物呈中性，保留強,峰性佳。需要全新的柱技術突破高純硅膠柱局限性的必要性硅膠柱pH適用極限010203050寬pH值色譜柱

突破硅膠柱應用禁區(qū)的有力手段優(yōu)點缺點無機基質(C18–硅膠)

機械強度高柱效高保留穩(wěn)定有限的pH應用范圍對堿性分析物拖尾化學不穩(wěn)定性有機基質(高聚物)

很寬的pH應用范圍無離子型作用化學穩(wěn)定性好機械強度不佳柱效低保留行為難以預測寬pH值色譜柱寬pH值色譜柱

突破硅膠柱應用禁區(qū)的有力手段優(yōu)點缺點無機基質51寬pH值色譜柱的幾種類型雙齒鍵合，Agilent寬pH值色譜柱的幾種類型雙齒鍵合，Agilent52四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters專利技術榮獲2000年全球R&D100大獎雜化顆粒柱(XTerra?)的合成過程示意四乙氧基硅烷硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙53Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)在硅膠聚合物網絡中嵌入的乙烷基橋鍵Anal.Chem.2003,75,6781-6788U.S.PatentNo.6,686,035B2第二代雜化顆粒技術TetraethoxysilaneBis(triethoxy54高pH條件下柱穩(wěn)定性的強化測試結果

柱壽命比超純硅膠柱提高十倍以上!高pH條件下柱穩(wěn)定性的強化測試結果

柱壽命比超純硅膠柱提高十55pH對填料穩(wěn)定性的影響高pH實驗pH>8時,許多C18硅膠基質過早地喪失柱效由于填料顆粒溶解,色譜柱內產生空隙隨著鍵合相覆蓋率的增加，色譜柱壽命延長低pH實驗pH<2時,許多C18硅膠基質過早地喪失柱效由于鍵合相之水解作用,被測物喪失保留行為使用三官能團鍵合相可獲得最佳的穩(wěn)定性pH對填料穩(wěn)定性的影響高pH實驗56靈敏度與選擇性的改變色譜柱:XTerra?RP18,4.6.x150mm,3.5μm檢測:254nm(相同進樣量)流動相:50%乙腈/40%水/10%含100mM

CAPSO,

pH10流動相:30%乙腈/60%水/10%含100mM磷酸鈉,

pH2.0MinutespH100.000.2524681012酮康唑阿司咪唑0酮康唑阿司咪唑AUpH2色譜圖重疊pH2與10：阿司咪唑與酮康唑分析靈敏度與選擇性的改變色譜柱:XTerra?RP18,457簡化方法開發(fā)過程123456789101112pH中間pH硅膠柱低pH硅膠柱高pH聚合物基質柱寬pH范圍填料色譜柱寬pH值色譜柱之寬pH范圍(以一當三)簡化方法開發(fā)過程123456789101112pH中間pH58溫度pH寬pH值色譜柱：高溫穩(wěn)定性溫度pH寬pH值色譜柱：高溫穩(wěn)定性59高溫壽命試驗PeakNumber

USPTailingFactor1.多慮平1.22.去甲替林1.13.阿米替林1.14.三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二天XTerra?RP18普通硅膠C18

Conditions:Column:XTerra?RP18,5μm,4.6X150mmMobilePhase:40%pH7,10mMNa2PO4,60%ACNColumnTemp.:60°CFlowRate:1.5mL/minDetector:254nm三環(huán)抗抑郁藥物分離高溫壽命試驗PeakNumberUSP60寬pH值色譜柱的優(yōu)點為方法開發(fā)提供了極其有效且方便的工具寬pH范圍良好色譜峰形高穩(wěn)定性寬pH值色譜柱的優(yōu)點為方法開發(fā)提供了極其有效且方便的工具61基于雜化顆粒的XTerraRP18柱與普通C18硅膠柱

在分離酸性、堿性化合物時的拖尾因子比較基于雜化顆粒的XTerraRP18柱與普通C18硅膠柱

在62為何雜化顆粒柱可增強在高pH下的柱壽命？硅膠快速溶解嚴重的柱失效柱壽命短暫SurfacemodifiedSilicaParticles因嵌入硅甲基的阻擋,顆粒表面溶解速度明顯減緩柱壽命大大延長XTerra?HybridParticles普通硅膠柱基于雜化顆粒的Xterra柱為何雜化顆粒柱可增強在高pH下的柱壽命？硅膠快速溶解Sur63基質溶解度

(ppm)12345678910 12240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-pH基質溶解度曲線傳統(tǒng)硅膠柱適用范圍pH2-7

各種基質的液相柱在高pH中溶解速率的比較液相柱基體材料的溶解導致柱前端形成空腔，由此而造成色譜峰畸形、分叉。現(xiàn)代超純硅膠柱適用范圍pH2-8寬pH值色譜柱適用范圍pH1-12基質溶解度(ppm)12364寬pH值色譜柱對創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的HPLC分析方法的獨特價值

Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer穩(wěn)定保留區(qū)穩(wěn)定保留區(qū)硅膠柱寬pH值色譜柱寬pH值色譜柱對創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的HPLC分析方法的獨特價值NDibucaine

(局部麻醉藥-堿性化合物)美國藥典USP28上所推薦的色譜方法淋洗劑:1.2g十二烷基磺酸鈉(SDS),0.2g醋酸鈉,2.0ml三乙基胺溶于300ml水中,調pH至5.6，然后加700ml甲醇3.9x300mmL1柱，要求拖尾因子<3.0

SDS:表面活性劑/離子對試劑

TEA:競爭堿為對抗峰拖尾而加入?文獻pKa=8.9Dibucaine

(局部麻醉藥-堿性化合物)美國藥典US66Minutes012分析柱:XTerra?RP18,4.6.x150mm,3.5μm檢測波長:254nm流動相:50%ACN/40%Water/10%aqueous100mMNH4HCO3,pH10.3USPTF1.026

GoodPeakShapeNoAdditivesSimplemobilephase用雜化柱在高pH下分析Dibucaine

拖尾問題迎刃而解Minutes012分析柱:XTerra?RP18,467Altretamine

(三嗪類抗癌藥物-強堿性化合物)美國藥典USP28上所推薦的色譜方法流動相:制備甲醇與緩沖液的混合液(790mg碳酸銨(NH4)2CO3溶于1000mL水中，調節(jié)pH至8.0±0.05)(65:35)色譜柱:一根以USPL1填制的4.6-mmx30-cm分析柱。USP拖尾因子不得大于1.5。pKa=10.3正確的做法是用碳酸氫銨而不是碳酸銨來配制緩沖液pH需要控制在±0.05范圍內

Altretamine

(三嗪類抗癌藥物-強堿性化合物)美68Minutes0612分析柱:XTerra?RP18,4.6.x150mm,3.5μm檢測波長:227nm流動相:50%ACN/40%Water/10%aqueous100mMNH4HCO3,pH10.0USPTF=1.08用雜化柱在高pH下分析Altretamine

柱壽命、峰拖尾和方法重現(xiàn)性問題迎刃而解Minutes0612分析柱:XTerra?RP18,69您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTailingRetention

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Reproducibility峰拖尾:28%保留時間不重現(xiàn):25%分離不佳:24%柱壽命太短11%極性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTail70我的色譜分離為何重現(xiàn)性不佳?儀器系統(tǒng)問題

泵精度、維修保養(yǎng)狀況色譜柱是否置于恒溫箱中

系統(tǒng)滯后體積發(fā)生改變(僅影響梯度分離!)

柱與柱間分離表現(xiàn)發(fā)生改變您的色譜柱是否購自可靠的生產和銷售廠家?

源自方法本身的問題

流動相的配制方法在無意中發(fā)生了改變分離可離子化化合物（酸、堿）未在流動相中使用緩沖液(或緩沖液的濃度不足)

流動相的pH值與被分析酸性、堿性化合物的pKa相近

我的色譜分離為何重現(xiàn)性不佳?儀器系統(tǒng)問題71梯度分離時系統(tǒng)滯后體積變化對分離時間的影響

10.0015.0020.0025.001234510.0015.0020.0025.00Minutes12345系統(tǒng)

A:泵滯后體積800μL系統(tǒng)

B:泵滯后體積

>1000μL分離在同一根色譜柱上進行!解決方案:1.在梯度表的每一個時間段中加入相應的補償時間

2.在Empower軟件上啟動‘柱前體積’功能梯度分離時系統(tǒng)滯后體積變化對分離時間的影響10.001572**需指明哪個溶劑先加（如將甲醇加入水中還是水加入甲醇中？）關于流動相pH的提醒:緩沖液的pH需在加入有機溶劑前調試！需要清楚地記錄并遵循流動相的配制順序!60/40600400流動相的配制順序:您常常忽視的細節(jié)**需指明哪個溶劑先加（如將甲醇加入水中還是水加入甲醇中？73pH0.111010002468101214保留因子(k)酸(未離子化)中性化合物堿1堿

1+2(完全離子化)酸(完全離子化)堿2NA,B1B2(未離子化)B1NAB2pH5.5pH6.0您的分析方法為何重現(xiàn)性不佳?流動相緩沖pH值是否靠近分析物的pKa范圍?

如圖所示,在靠近中性pH區(qū)間分析可離子化化合物時需要對流動相pH進行非常仔細的控制!!

pH0.111010002468101214保留因子(k)740.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.01230.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.4312pH5.20.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH5.61320.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl分析方法對pH敏感度的測試-糟糕的結果Column:XTerra?RP184.6x100mm,5μmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8) or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10μLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA0.0000.401.002.003.750.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH7.03120.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH6.83121.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl132pH5.81.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.000.0000.40Column:XTerra?RP184.6x100mm,5μmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8) or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10μLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA分析方法對pH敏感度的測試-糟糕的結果0.0000.401.002.003.76分析方法對pH敏感度的測試-優(yōu)異的結果分析方法對pH敏感度的測試-優(yōu)異的結果77雜化顆粒柱對創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的HPLC分析方法的獨特價值

Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer穩(wěn)定保留區(qū)穩(wěn)定保留區(qū)硅膠柱Xterra&X-Bridge雜化顆粒柱雜化顆粒柱對創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的HPLC分析方法的獨特價值Not您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTailingRetention

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Reproducibility峰拖尾:28%保留時間重現(xiàn)性不佳:25%分離不佳:24%柱壽命太短11%極性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTail79我的色譜柱壽命為何不長?您是否有恰當?shù)臉悠非疤幚硎侄?

樣品前處理(凈化和富集)的好壞不僅影響分析結果的靈敏度和可靠性，而且直接影響色譜柱的壽命

您的色譜柱是否有適當?shù)谋Ｗo措施?

在線過濾器保護柱

您的色譜柱是否曾暴露在過于劇烈的分離條件?

使用某些對填料基體有腐蝕性的高濃度緩沖鹽

(如在中性或堿性pH區(qū)域使用高濃度緩沖鹽的磷酸鹽或硼酸鹽)

柱溫過高

將色譜柱暴露在極端pH的流動相中

我的色譜柱壽命為何不長?您是否有恰當?shù)臉悠非疤幚硎侄?80您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTailingRetention

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Reproducibility峰拖尾:28%保留時間不重現(xiàn):25%分離不佳:24%柱壽命太短11%極性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面臨的常見問題PeakTail81()()1kk14NRs22+′a-a′÷???è?=影響分離度的若干因素柱效N-2,R-40%分離選擇性(方法開發(fā)歸根結底是如何使得a11)保留因子K最佳=5()()1kk14NRs22+′a-a′÷???è?=影響分82如何在實踐中調控

‘a’?

這是方法開發(fā)的根本!低高pH甲醇乙腈溶劑類型C18RP18C8RP8苯基色譜柱化學a選擇性如何在實踐中調控‘a’?

這是方法開發(fā)的根本!低高pH甲醇83溶劑選擇性常用溶劑:甲醇(MeOH)乙腈(MeCN)其他溶劑:異丙醇(IPA)乙醇(EtOH)THF(Tetrahydrofuran)使用不同溶劑，可以改變選擇性和洗脫強度溶劑選擇性常用溶劑:使用不同溶劑，可以改變選擇性和洗脫強度84反相色譜中選擇性的調節(jié)工具

色譜柱選擇溶劑pH

a

選擇性1不同類型2不同鍵合相3不同品牌反相色譜中選擇性的調節(jié)工具色譜柱選擇溶劑pH85色譜柱選擇色譜柱選擇86反相色譜中選擇性的調節(jié)工具

色譜柱化學溶劑pH

a

選擇性反相色譜中選擇性的調節(jié)工具色譜柱化學溶劑pH87選擇性與pH僅影響帶離子型官能團的待測物如：胺，羧酸及酚類等pH不影響不能發(fā)生電離的中性物質的保留

大多數(shù)藥物含有一個或多個離子型官能團pH變化引起的選擇性變化最大選擇性與pH僅影響帶離子型官能團的待測物88

pH帶來的保留與選擇性變化化合物從離子化狀態(tài)變化到非離子化狀態(tài)其保留因子變化10到30倍上述變化相當于有機溶劑的比例變化20%pH帶來最顯著的選擇性變化pH是方法開發(fā)最強有力的選擇性調節(jié)工具

pH帶來的保留與選擇性變化化合物從離子化狀態(tài)變化到非離子化89方法開發(fā)的基本思路

哪一根色譜柱可以在低PH下得到:所有雜質峰基線分離?所有雜質峰之峰形良好?主峰與雜質完全分離(用PDA或MS確定峰純度)?次要色譜峰足夠的信噪比(S/N)?如果答案是肯定的，則選擇此色譜柱，并在此基礎上進一步優(yōu)化方法(有機相比例)如果答案是否定的，嘗試使用高pH分離條件90方法開發(fā)的基本思路哪一根色譜柱可以在低PH下得到:9090運行低pH快梯度：在選擇性不同的所有色譜柱上確定等度分離條件在選擇性不同的幾根色譜柱上運行低pH等度分離實驗－藥物破壞性實驗產物(降解原料藥)對上述結果滿意嗎?運行高pH快梯度：

硅膠基質色譜柱@pH7

雜化基質色譜柱@pH10確定等度分離條件在選擇性不同的幾根色譜柱上運行高pH等度分離實驗－藥物破壞性實驗產物(降解原料藥)對上述結果滿意嗎?選擇色譜柱并優(yōu)化等度方法選擇色譜柱并優(yōu)化等度方法是是否其他選擇：1.考慮用甲醇替換乙腈2.考慮采用更高的溫度否HPLC方法開發(fā)思路91運行低pH快梯度：在選擇性不同的所有色譜柱上確定等度分離條件91頻繁切換分析柱、流動相溶劑和緩沖液過于繁瑣？

自動方法開發(fā)系統(tǒng)（AMDSsystem）可幫您解決問題…

ACBDSolventSelector:ControlledviaContactClosuresD3D2D1MobilePhases:A H2OB MeCNC MeOHD1 pH3NH4COOHD2 pH10NH4HCO3D3 10%MeCN(valvewash)Totalof6bottlescanbeusedforlineD.3/6columnselectorNote:Forfullcontrolviacomputer,upgradetoEmpowersoftware.頻繁切換分析柱、流動相溶劑和緩沖液過于繁瑣？

自動方法開發(fā)系92探索性HPLC方法開發(fā)

優(yōu)化條件甲醇,低pH

乙腈,

低pH甲醇,高pH乙腈,

高pH

XTerra?

RP18

XTerra?

MSC18

XTerra?

Phenyl探索性HPLC方法開發(fā)優(yōu)化條件甲醇,乙腈,甲醇,乙93色譜條件色譜柱規(guī)格4.6mmx50mm,3.5mm梯度洗脫0%to80%,tg=15minMeOH和MeCNpH3(甲酸銨緩沖液)或pH9(碳酸氫銨緩沖液)流速=2mL/min溫度=30oCAlliance?HPLC系統(tǒng)色譜條件色譜柱規(guī)格94例:利尿劑分離極性相差很大的9種物質用梯度方法考察pH、固定相，及流動相對分離的影響選擇最佳色譜條件，最終獲得梯度分離結果例:利尿劑分離極性相差很大的9種物質95梯度分離測試混合物：利尿劑

5

Benzthiazide(WA)8

Bumetanide(Z)7利尿酸(Ethacrynicacid,A)6丙磺舒(Probenecid,A)4利尿磺胺(Furosemide,Z)2氯噻酮(Chlorthalidone,WA)9Canrenoicacid(A)1氨苯喋啶(Triamterene,B)3Althiazide(WA)梯度分離測試混合物：利尿劑5Benzthiazide96利尿劑:使用乙腈的起始梯度分離pH3.64

pH9.0Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00124397568XTerra?Phenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra?RP1812358974612439,57680.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra?MSC180.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0012965,387XTerra?MSC1843Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra?Phenyl4162,9,8,750.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra?RP184126985,73Wagrowski,Tran利尿劑:使用乙腈的起始梯度分離pH3.64 97pH3.64

pH9.0436,1,587,9XTerra?PhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.002Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra?RP18123,458,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerra?PhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0043,215,689,7XTerra?MSC1842,16,3859,7XTerra?RP18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra?MS73Wagrowski,Tran利尿劑:使用甲醇的起始梯度分離pH3.64 pH9.0436,1,587,9XTe98兩種條件下的分離結果考察沒有任何起始條件可以完全分離所有化合物pH帶來最大的選擇性變化堿性pH條件下色譜峰間隔較小

酸性pH條件下色譜峰的分離度較大兩種條件下的分離結果考察沒有任何起始條件可以完全分離所有化合99利尿劑酸性pH條件下的起始梯度分離比較:Wagrowski,Tran乙腈

甲醇Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra?RP18123,456,78,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerra?PhenylMinutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010124397568XTerra?Phenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010XTerra?RP181258974630.001.002.003.004.005.006.007.008.009.001012439,5768XTerra?MSC18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra?MS尿劑酸性pH條件下的起始梯度分離比較:Wagrowski,100甲醇體系：最終梯度優(yōu)化結果色譜柱:XTerra?MSC18;4.6x50mm3.5μm.柱溫：30°C.流速:2.0mL/min.檢測:254nm.進樣體積:20μl.運行時間:20min.流動相:A:100mM甲酸銨pH3.64.B:水;C:甲醇

樣品濃度:20μg/mL0.015Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra?MSC18起始梯度1245678930.060Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.00123456789XTerra?MSC18最終梯度分離結果Time(min)%A%B%C0 109001 105040310464410 10464411 109001510900TriamtereneChlorthalidoneAlthiazideFurosamideBenzthiazideProbenecidEthacrynicacidBumetanideCanrenoicacidWagrowski,Tran甲醇體系：最終梯度優(yōu)化結果色譜柱:XTerra?MSC1101利尿劑分離樣品復雜：樣品中含有9種化合物基于起始梯度實驗的結果，優(yōu)化了色譜柱類型，有機相比例及pH平梯度獲得最終滿意分離結果利尿劑分離樣品復雜：樣品中含有9種化合物102pH9.0條件下的溶劑選擇性：

等度分離條件探索Wagrowski,Tran3,5Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00129687XTerra?MSC184乙腈42,315,689,7甲醇pH9.0條件下的溶劑選擇性：

等度分離條件探索Wagro103利尿劑：

pH9條件下最終的等度分離條件流動相:A:乙腈;B:甲醇;C:水;D:100mM甲酸銨,pH9.0等度條件:A:13%(乙腈);B:4%(甲醇);

C:73%(水);D:10%(甲酸銨)XTerra?

MSC184.6x50mm,3.5μmAU0.000.020.04Minutes0.02.04.06.08.010.012.014.016.01423659871.Triamterene2.Chlorthalidone3.Althiazide4.Furosemide5.Benzthiazide6.Probenecid7.Ethacrynicacid8.Bumetanide9.Canrenoicacid利尿劑：

pH9條件下最終的等度分離條件流動相:A:104等度分離利尿劑堿性pH條件下的峰間隔較小(色譜峰緊密排列)的洗脫狀況，使得等度分離成為可能通過溶劑選擇性進行微調，最終實現(xiàn)完全分離使用小顆粒短柱(5cm,3.5μm)，在pH9可實現(xiàn)色譜峰的完全分離等度分離利尿劑堿性pH條件下的峰間隔較小(色譜峰緊密排列)的105重要的方法開發(fā)為何要從新色譜柱開始？

隨使用條件和樣品潔凈度的不同，多數(shù)色譜柱在使用過程中可發(fā)生化學污染、表面狀態(tài)改變、基體材料部分溶解等等潛在變化。此類改變可導致柱內填料的活化或鈍化，使其對某些化合物的分離選擇性加強或變劣。此類特殊分離選擇性常常是無法重復的。在此類舊色譜柱建立起來的方法將無法在新柱和其他舊色譜柱上得以重現(xiàn)，造成未來可能需要重新開發(fā)方法或進行大量針對儀器系統(tǒng)、色譜柱和流動相的不必要的診斷工作。

重要的方法開發(fā)為何要從新色譜柱開始？隨使用條件和樣品潔凈度106反相色譜柱的選擇小結:(1)常規(guī)應用現(xiàn)代高純硅膠色譜柱：優(yōu)點：峰形好，重現(xiàn)性高，壽命長限制：pH2-8流動相中含有大量水溶液采用AQ技術：優(yōu)點：在含有大量水溶液（100％水溶液）流動相中性能穩(wěn)定：峰形好反相色譜柱的選擇小結:(1)常規(guī)應用107需要使用寬pH值或高溫條件－如生物堿分離寬pH值色譜柱：pH1-12優(yōu)點：pH范圍寬，高溫條件下填料穩(wěn)定性好，色譜峰形好，壽命長采用質譜檢測器:窄內徑/小顆粒/短柱反相色譜柱的選擇小結:(2)需要使用寬pH值或高溫條件－如生物堿分離反相色譜柱的選擇小108結語現(xiàn)代液相色譜柱技術在改善分析物峰對稱性、提高在嚴苛分析條件（如高、低pH）下的柱壽命、簡化分離方法的建立和提高分析實驗室生產力方面均扮演著不可替代的作用。應用現(xiàn)代多平臺色譜柱技術(EcosilC18-SH、C18-EPS、C18-AQ、C18-Extend以及Zic-HILIC系列)，結合對流動相溶劑和pH的系統(tǒng)化調控，是方便快速地進行分析方法開發(fā)的最佳途經。廣州綠百草以為色譜工作者提供最優(yōu)質、最穩(wěn)定可靠的柱產品為己任。我們豐富的應用經驗為達致以上目標提供了堅強保障。結語現(xiàn)代液相色譜柱技術在改善分析物峰對稱性、提高在嚴苛分析條109一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分1906年俄國植物學家Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分1906年俄國植物110111高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結構色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產生原理高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱2高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結構高壓泵進樣器檢1111Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色譜分離基本原理PartitioncoefficientK分配系數(shù)1Basicprincipleofchromatog112硅膠顆?；|合成步驟：1.合成硅膠基質2.鍵合配體(鍵合相)3.端基封尾end-capped硅膠顆?；|合成步驟：113以傳統(tǒng)方式制造硅膠色譜填料的過程:

起始原料為礦物硅酸鹽（如泡花堿），即A類硅膠90年代以后方式：organosilicapolymer有機單晶硅聚合的硅膠，即B類硅膠以傳統(tǒng)方式制造硅膠色譜填料的過程:

起始原料為礦物硅酸鹽（114色譜柱分類與選擇-內部培訓講義資料課件115填料的端基封尾–封口殘余硅羥基–減少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）C18鍵合并端基封尾后還能看見什么？硅羥基!—即使進行高密度鍵合，硅膠表面仍將殘留約50%硅羥基(SiOH)!填料的端基封尾C18鍵合并端基封尾后116單、雙、三官能團鍵合三官能團鍵合二官能團鍵合單官能團鍵合單、雙、三官能團鍵合三官能團鍵合二官能團鍵合單官能團鍵合117鍵合鍵合118常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷極性封尾，增加極性保留HypersilODS即沒有封尾HypersilODS-2有封尾由于空間位阻的存在，鍵合反應最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團會發(fā)生離子交換作用，增加了保留，