超聲法與酶切法隨機打斷基因組方法的比較李瑩;王闊鵬;于凌嬌瀏麒瀏倩宏【摘要】將細菌基因組隨機打斷，是構建隨機文庫的第一步，也是構建隨機、多樣文庫的一個重要保障物理法（超聲波）和酶切法是兩種常用的斷裂基因組的方法.本試驗采用超聲法和酶切法對馬耳他布魯菌16M株基因組進行隨機打斷，并比較二者的打斷效果，為后續(xù)建立布魯菌基因組隨機文庫奠定基礎.結果表明，用超聲法（超聲條件:輸出功率50%,超聲3s,間隔3s,超生次數(shù)10下）隨機打斷布魯菌基因組效果最好.【期刊名稱】《吉林農(nóng)業(yè)科技學院學報》【年（卷），期】2018（027）004【總頁數(shù)】4頁（P4-7）【關鍵詞】超聲法;酶切法；Sau3AI【作者】李瑩;王闊鵬;于凌嬌瀏麒瀏倩宏【作者單位】吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院;;;;吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院吉林132101【正文語種】中文1材料與方法1.1試驗材料1.1.1試驗材料及儀器馬耳他布魯菌16M株（標準熱滅活）、NEB公司基因組提取試劑盒、瓊脂糖、異丙醇、70%乙醇、0.2%漠酚藍、50%蔗糖上樣緩沖液、電泳緩沖液、1mg/mL漠化乙錠溶液(EB)、10x酶切緩沖液、Sau3AI限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。超聲波細胞破碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)、電泳儀、凝膠成像儀、高速離心機、超低溫冰箱、高壓滅菌鍋、水浴鍋、穩(wěn)壓電泳儀、電泳槽、紫外檢測儀、EP管、離心管、微量移液器、量筒、燒杯、錐形瓶、吸嘴、剪刀、鑷子、塑料手1.1.2試劑配制氨芐青霉素(Ampicillin)配置(濃度100mg/mL):稱取5gAmp,在50mL離心管加入稱好的Amp，并加入40mL無菌水，使其充分混合溶解之后，定容到50mL。采用規(guī)格為0.22pm的濾膜過濾除菌，再分裝成小份(約1mL/管)，在-20°C中保存。無菌水的制備：量取50mL重整水，在100mL三角瓶中加入稱量好的重整水，高壓滅菌20min后，用高壓滅菌后的EP管分裝,-20C保存?zhèn)溆谩?.2試驗方法1.2.1基因組提取用NEB公司基因組提取試劑盒提取馬耳他布魯菌16M株基因組，具體按試劑盒操作，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組提取結果［1-5］。1.2.2軟件DNAMAN分析基因組用DNAMAN分析16M株基因組序列，識別Sau3AI酶切位點，預測該酶可能的酶切片段大?。?］。1.2.3Sau3AI酶切基因組根據(jù)Sau3AI酶的使用說明書，進行如下操作：在0.5mLEP管中，建立基因組DNA酶解的混合體系；并將混合物置于55C水浴中，水浴15min,使基因組DNA片段被分散。10xSau3AI緩沖液5pL提取的基因組DNA20pL(25-60pg)無菌重整水75pL共100pL。將(1)中液體分裝在5個Ep管中(Ep管需要標記數(shù)字1、2、3、4、5,便于區(qū)分)，其中1管為30pL,2管-4管各為20mL,5管為10pLo5個Ep管冰浴放置。⑶根據(jù)3-10U/pgDNA的量，加入Sau3AI酶于1笥輕輕彈動管壁，利于二者混勻，短暫離心2s后，收集反應物，并在冰上放置。⑷用微量移液器在1管中吸取10pL液體放入到2管中，立刻混勻，混勻后放置在冰上。梯度稀釋。在2管中，用移液器取10pL液體到3笥在3管中取10pL液體至4管,4管10pL液體到5管。注意：連續(xù)稀釋后，每管體積都是20pL。在37°C時，保溫20min,然后在68°C水浴鍋中水浴5-8min,使Sau3AI內(nèi)切酶失活，在冰上放置。在各酶解產(chǎn)物管中分別取4pL，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，大約電泳5-16h,判斷酶解產(chǎn)物的大小范圍［7］。1.2.4超聲裂解法打斷基因組利用超聲波細胞破碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)隨機打斷布魯菌基因組［8-9］。超聲條件設定見表1。表1超聲組別組別輸出功率超聲時間超聲間隔超聲次數(shù)150%3s3s30下250%3s3s20下350%3s3s10下1.2.51%瓊脂糖凝膠電泳檢測利用電泳檢測兩種方法隨機打斷基因組情況。制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，放在錐形瓶中，加一倍濃度的電泳緩沖液(1X電泳緩沖液)，輕輕晃動幾下，用微波爐加熱，使融化均勻。加熱之前，錐形瓶口要密封，減少在加熱過程中水分的蒸發(fā)。制備膠板：把膠槽放到制膠板上，插上梳子，注意梳子齒末端與膠槽底部保留大約1mm距離。等到凝膠溶液冷卻到50°C時，加濃度為0.5pL/mL的EB，輕輕地搖勻，慢慢將其倒入到制膠板中，要注意消滅氣泡。等到凝膠冷卻凝固后，將梳子拔出。將凝膠放入到電泳槽內(nèi)，加1X電泳緩沖液，使緩沖液液面比瓊脂糖凝膠面高一點點。加樣：把樣品DNA和樣品緩沖液混合在點樣板上，用10"微量移液器取樣加在樣品槽中，每次加樣都要更換槍頭，防止污染，影響結構。加樣時要小心謹慎，勿觸碰樣品孔周圍，記住加樣順序、加樣量。注意：樣品緩沖液不小于1X。⑷電泳：加樣后，應立刻通電進行電泳。樣品從黑色負電極移動至紅色正電極。當漠酚藍移至距離膠板下緣1cm處時，停止電泳。(5)拍照觀察：電泳后取出凝膠。在波長為254nm的紫外線下，觀察電泳膠板?？梢钥吹皆贒NA存在的位置，有橘紅色條帶。用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存。圖1布魯菌基因組1.Marker從上到下大小依次為100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2.馬爾他布魯菌16M株DNA提取結果2試驗結果2.1馬耳他布魯菌16M基因組提取結果用NEB公司基因組提取試劑盒提取布魯菌16M基因組，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析，結果見圖1。結果顯示提取基因組成功，且DNA提取濃度較高；經(jīng)OD260/280分析，基因組純度也達到要求。2.2軟件分析結果Sau3AI識別酶切位點為GATC。軟件預測布魯菌16M株基因組(NC_003317.1)經(jīng)Sau3AI酶切圖譜如圖2。結果表明布魯菌16M株基因組上有Sau3AI酶的酶切位點，且經(jīng)酶切后得到的線性DNA片段大小分別為30bp,42bp,120bp,127bp,267bp,503bp;得到的環(huán)形DNA片段大小分別為30bp,42bp,120bp,127bp,770bp。酶切后得到線性DNA片段為30bp,42bp,120bp,127bp,267bp,503bp;得到的環(huán)形DNA為30bp,42bp,120bp,127bp,770bp。圖2Sau3AI酶切位點圖圖3酶切法打斷基因組l.Marker從上到下大小依次為100bp,250bp,500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2-3.Sau3AI酶切基因組結果圖4超聲法打斷基因組1.Marker從上到下大小依次為100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2.超聲30下；3超聲20下；4.Marker；5.超聲10下2.3酶切法隨機打斷基因組結果Sau3AI酶切馬耳他布魯菌16M株基因組，用瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，結果見圖3。結果表明酶切的基因片段比較小，并且分布均勻。2.4超聲法隨機打斷基因組結果采用3組不同超聲裂解條件，對16M株基因組隨機打斷，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖4。結果表明輸出功率50%，超聲3s,間隔3s,超聲次數(shù)為10下，效果最好。2.5基因組打斷效果檢測分析本試驗的目的是為了建立布魯菌基因組隨機文庫，通過用Sau3AI酶切和超聲破碎基因組，得到想要的基因片段，為后續(xù)試驗做準備。所需基因片段大小約為200-3000bp之間，片段均勻，大小適中。而通過電泳檢測可知，酶法得到的基因片段大多數(shù)都是小片段，超聲法得到的片段為一條抹帶，范圍在200-3000bp，符合后續(xù)試驗需要。3分析與討論利用超聲法處理基因組具有設備簡單，操作方便，樣品損失少，處理速度快，有利于分離純化，具有良好的通透性，易于實現(xiàn)連續(xù)化、自動化，樣品處理量大，成本低，轉化率高等優(yōu)點。酶法顯著的特點是專一性強，樣品處理速度快，比較溫和，并且能夠更好的保留DNA完整性以及蛋白質(zhì)的抗原表位。超聲法對DNA的打斷是隨機的，且實驗重復性較高。對于那些與DNA結合不緊密的蛋白或低豐度表達的蛋白，如調(diào)控因子、轉錄因子等通常需要用交聯(lián)試劑固定樣本(細胞或組織)以穩(wěn)定蛋白質(zhì)和DNA的形態(tài)，這種情況最好用超聲法。如果樣本無需交聯(lián)，例如研究對象是與DNA結合緊密的蛋白或高豐度表達的蛋白，那么便可以使用酶法。但酶切法得到的DNA片段相對較短，不適合染色質(zhì)免疫共沉淀技術及與芯片方法的結合(CHIP-Chip)實驗和染色質(zhì)免疫沉淀測序(CHIP-Seq)實驗。研究擬利用隨機打斷的基因組DNA片段構建布魯菌16M株隨機文庫，基因組DNA片段的質(zhì)量(包括片段的濃度、大小等)直接決定構建文庫的多樣性及隨機性。因此，本研究比較了酶切法和超聲法對基因組DNA的隨機打斷效率，并對超聲法裂解基因組DNA進行了條件優(yōu)化，為后續(xù)隨機文庫構建你奠定基礎。4結論試驗通過比較超聲法和酶切法隨機打斷布魯菌16M株基因組效果，為后續(xù)建庫奠定基礎。結果表明，超聲法(輸出功率50%，超聲3s,間隔3s,超聲次數(shù)10下)效果更好。參考文獻：【相關文獻】薛鵬飛，柳鵬福，史吉平，等.鹽單胞菌Fosmid文庫構建及群體感應淬滅酶的篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44(10):88-91.趙志祥，蘆小飛，陳國華，等.溫室黃瓜根結線蟲發(fā)生地土壤微生物宏基因組文庫的構建及其—個殺線蟲蛋白酶基因的篩選[J].微生物學報，2010,50(8):1072-1079.陳誠,喬軍,孟慶玲，等.綿羊肺炎支原體基因組DNA表達文庫的構建與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2016,25(5):646-651.趙曉宇，孟利強，曹旭，等.高效生防菌B29抗菌物質(zhì)基因組文庫的構建[J].黑龍江科學，2013(9):18-20.管健.植物基因組DNA提取及酶切技術的初步探討[J].黑龍江科技信息，2013(30):128.呂燕寧，郭瀟瀟,陳麗娟，等.兩株布魯菌MLST新序列型(ST)的鑒定[J/OL].中國人獸共