高速逆流色譜原理

高速逆流色譜

是

20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液—液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相

逆流色譜優(yōu)點(diǎn)A無固相載體，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖尾等缺點(diǎn)；B粗提物可進(jìn)樣分離，，有機(jī)溶劑消耗少，無損失、高效、快速和制備量大等優(yōu)點(diǎn);C與HPLC相比，HSCCC進(jìn)樣量較大，最多可達(dá)幾克，是HPLC的104-105

倍;D與常壓和低壓色譜相比，HSCCC的分離能力強(qiáng)，經(jīng)過1次分離就可以得到1個(gè)甚至多個(gè)單體，并且分離時(shí)間短。液滴逆流色譜(DCCC)缺點(diǎn):流動相流速低，每小時(shí)只有十幾毫升，需要幾十小時(shí)才能完成一次幾個(gè)組分的分離收集器進(jìn)樣器溶劑泵約300根管柱上行法收集器

進(jìn)樣器溶劑泵約300根管柱下行法分離原理：基于流體動力學(xué)原理

（1）假設(shè)上圖是一個(gè)充滿水的兩端用橡皮塞封閉的螺旋橡圈，讓一個(gè)石子和一個(gè)空氣泡從左端進(jìn)入管中，由于兩者與水的密度不同，因此小石子處于螺旋管底部，而空氣泡處于頂部，按圖所示慢慢旋轉(zhuǎn)螺旋管，則空氣泡和小石子皆從左向右移動，據(jù)此我們定義稱螺旋管左端為尾端，右端為首端（2）如果在此充滿水的螺旋管的左邊加入一滴與水互補(bǔ)相溶的氯仿，由于氯仿的密度比水大，這滴氯仿就沉在螺旋管的下面，慢慢旋轉(zhuǎn)螺旋管，氯仿也會從左向右移動。如果將螺旋管里面的水換成氯仿，讓一滴水從左邊進(jìn)入螺旋管，則由于水密度比氯仿小，這一滴水就浮在螺旋管的上面，慢慢轉(zhuǎn)動螺旋管，則水滴也會從左向右移動。（3）如果在螺旋管中同時(shí)各充滿50%的氯仿和水，兩端仍用橡皮塞密封，當(dāng)按圖所示旋轉(zhuǎn)螺旋管時(shí)，則互不相溶的兩相都從左向右移動，相互競爭。在經(jīng)歷一段時(shí)間并達(dá)到平衡之后，氯仿以小的液滴均勻的分散在螺旋管中，如果此時(shí)停止旋轉(zhuǎn)螺旋管，讓其靜置，則可以觀察到螺旋管的每一圈中，水在上面，氯仿在下面，并各占50%。

以上都是螺旋管在慢速轉(zhuǎn)動的情況下螺旋管中兩相的特性，其主要作用來自于重力，，慢速轉(zhuǎn)動的離心力可以忽略不計(jì)（5）由于高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管中互不相容的兩相具有上述性質(zhì)，因此當(dāng)我們將螺旋管的左端與恒流泵相連，將水相首先充滿螺旋管并高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，管中水相將向恒流泵的方向移動，但由于其輸液出口由單向閥控制，阻止了水相的左移而被固定在螺旋管中，此時(shí)我們再用恒流泵以一定的速度從左邊泵入氯仿，由于在此兩相中氯仿有向螺旋管右側(cè)移動的趨勢，氯仿相就能以小液滴的方式穿過螺旋管中的水相。如果將此系統(tǒng)作為分配色譜系統(tǒng)，則水起到了固定相的作用，氯仿就是移動相。高速逆流色譜操作（一）兩相溶劑的選擇（二）樣品溶液的制備（三）分離（四）檢測

（一）兩相溶劑的選擇

1.兩相溶劑（1）選擇的溶劑系統(tǒng)需要能分成兩相，這是逆流色譜進(jìn)行分離的先決條件（2）較快的分層時(shí)間，一般不超過30秒（3）兩相溶劑可以是二組分或者多組分，最好分層后兩相體積大致相等，有利于節(jié)省溶劑。（4）溶劑系統(tǒng)不造成樣品的分解或變性，應(yīng)該具有相當(dāng)?shù)娜芙舛?.固定相的足夠高保留在儀器工作時(shí)，由于移動相的泵入，總是要從螺旋管中排擠出一部分固定相，一般情況下螺旋管中保持的固定相越多，樣品的分離效果越好，理想的溶劑系統(tǒng)固定相的保留百分?jǐn)?shù)往往大于50%,其保留百分?jǐn)?shù)主要受溶劑種類及各組分之間的比例影響，還受儀器參數(shù)β和轉(zhuǎn)數(shù)大小的影響3.樣品在溶劑中合適的分配系數(shù)樣品在兩項(xiàng)中適當(dāng)?shù)姆峙湎禂?shù)是成功的關(guān)鍵K=C固/C流，研究表明，合適的分配比在0.5-2的范圍內(nèi)，k小于0.5則色譜峰出得太快，達(dá)不到的分離效果，k大于2則色譜峰出得慢，浪費(fèi)大量溶劑分配系數(shù)K可以通過HPLC進(jìn)行簡單測定。對于一個(gè)待分離物首選氯仿-甲醇-水體系（2:1:1），如果分配系數(shù)在0.2-5可以通過改變?nèi)叩谋壤_(dá)到較佳的溶劑體系。如果K小于0.2則采用正己烷-乙酸乙酯/甲醇-水，如果分配比還比較小，則用正己烷/甲醇-水體系。如果K大于5則考慮用乙酸乙酯-正丁醇-水或者正丁醇-水體系。（皂苷、強(qiáng)心苷、黃酮苷、多酚類等）（香豆素、醌類、苯丙素、生物堿、黃酮等）（萜類、甾體、脂肪酸等）（三）分離

（1）先將兩相溶劑系統(tǒng)預(yù)平衡，混合，振搖，靜置，分層，收集上下相（2)量取等量的上下相，溶解樣品（3)把固定相泵入線圈，大概10mL/min，觀察是否有液體放出