克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測及百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測摘要：為熟悉鹽酸克倫特羅(瘦肉精)的不同檢測方法，本實驗采用了克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測和鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測兩種方法對鹽酸克倫特羅陽性樣品和陰性樣品進(jìn)行了檢測，求出了陽性樣品和陰性樣品中的鹽酸克倫特羅含量。并對兩種鹽酸克倫特羅的檢測方法進(jìn)行了簡單比較。結(jié)果表明，ELISA檢測法具有具有特異性強、便于大規(guī)模檢查及適合現(xiàn)場和基層使用等優(yōu)點。而快速檢測卡則具有敏感、特異、快速、簡便,且無需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點。關(guān)鍵詞：鹽酸克倫特羅(瘦肉精)、ELISA檢測、快速檢測卡1前言：鹽酸克倫特羅(瘦肉精)又名克喘素、氨哮素、雙氯醇胺，化學(xué)名為α-［(叔丁氨基）甲基］4-氨基-3,5二氯苯甲醇鹽酸鹽。它是一種β腎上腺受體激動劑，是一種白色或類似白色的結(jié)晶體粉末，無臭，微苦，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，加熱到170℃才能分解。因此，一般的烹調(diào)加熱方法不能將豬肉和臟器中殘留的“瘦肉精”毒性破壞。長期攝入鹽酸克倫特羅超標(biāo)的豬肉，會造成人體胃腸道菌群失衡、發(fā)生過敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)并產(chǎn)生“三致”作用ADDINNE.Ref.{3514D58C-CDF7-4B4C-92A5-31128AD3F906}[1]。因此必需建立有效的檢測方法，完善對畜牧業(yè)的監(jiān)管，以保障食品的質(zhì)量，讓消費者吃得放心。2材料與方法2.1實驗材料與試劑2.1.1克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測克倫特羅ELISA試劑盒：百?；蚱渌惍a(chǎn)品。試劑盒包含如下試劑：酶標(biāo)記物（綠蓋）1瓶3,3’5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物液（黑蓋）1瓶底物緩沖液（白蓋）1瓶終止液（黃蓋）1瓶濃縮洗液（透明白蓋）1瓶0μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶0.1μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶0.3μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶0.9μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶2.7μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶8.1μg/L克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液（紅蓋）1瓶包被偶聯(lián)抗原的96孔酶標(biāo)板（12條8孔可拆酶標(biāo)條）1塊塑料封口袋1個內(nèi)裝干燥劑1袋鹽酸克倫特羅陽性樣品鹽酸克倫特羅陰性樣品2.1.2百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測鹽酸克倫特羅陽性樣品2.2實驗儀器2.2.1克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測微量移液器：100或200μL水浴鍋或烘箱：保溫，可選。酶標(biāo)儀：MK-13或同類儀器。洗瓶：500mL，手洗時盛裝洗液。吸水紙：吸干板條殘留液體。樣本：尿液或組織樣品或飼料樣品。蒸餾水。洗板機：可選，可用手洗替代。移液器配套槍頭：100或200μL規(guī)格。槍頭盒。2.2.2百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡2.3實驗方法2.3.1克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測（1）取出96孔酶標(biāo)板，將需用的條板固定于支架，按順序編號。1~6號孔為標(biāo)準(zhǔn)品孔，7號孔為陽性樣品孔，8為號孔陰性樣品孔；（2）在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50μL待測樣品。然后每孔加入50μL抗體工作液（加入標(biāo)品和樣品時無時間差的影響），輕拍混勻，蓋好。37℃條件下溫育30min；（3）倒出孔中的液體，用洗液充入各孔中，輕輕振蕩，倒出孔中的液體，在吸水紙上連續(xù)拍打3次以上，以保證完全除去孔中的液體，重復(fù)操作5遍；（4）每孔加入100μL酶標(biāo)記物，蓋好。37℃條件下溫育20min；（5）倒出孔中的液體，用洗液充入各孔中，輕輕振蕩，倒出孔中的液體，在吸水紙上連續(xù)拍打3次以上，以保證完全除去孔中的液體，重復(fù)操作5遍；（6）每孔加入100μL顯色液，輕輕振蕩，蓋好。37℃條件下溫育10min；（7）每孔加入50μL反應(yīng)終止液，混勻后在波長450nm（以空氣為空白）測定各孔吸光值（必須在加入終止液后60min內(nèi)讀取吸光值。2.3.2百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測（1）使用前將待檢樣本溶液恢復(fù)至室溫；（2）從原包裝袋中取出檢測卡，并于一個小時內(nèi)使用；（3）將檢測卡平放，用移液槍吸取待檢樣品溶液100μL垂直加于加樣孔，開始計時；（4）結(jié)果應(yīng)在3~5min讀取，其他時間判讀無效，根據(jù)示意圖判定結(jié)果。結(jié)果判定：陰性（陰性（-）：兩條紫紅色條帶出現(xiàn)。表示樣品中鹽酸克倫特羅濃度低于3ng/mL，或不含有。陽性（+）：檢測T線無顯色，則表示樣品中鹽酸克倫特羅濃度高于3ng/mL。無效：未出現(xiàn)質(zhì)控C線，表明操作過程不正確或檢測卡已失效。3實驗結(jié)果與分析3.1克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測圖1克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線圖根據(jù)上圖計得出鹽酸克倫特羅陽性樣品與鹽酸克倫特羅陰性樣品中的克倫特羅含量如下圖：表1樣品中克倫特羅的含量樣品OD值1OD值2平均OD值相對OD值ln濃度濃度（μg/L）鹽酸克倫特羅陽性樣品0.3480.3360.34274.7541.6645.280鹽酸克倫特羅陰性樣品1.6321.8851.759384.372-1.9490.142實驗結(jié)果表明，鹽酸克倫特羅陽性樣品中的克倫特羅含量高于鹽酸克倫特羅陰性樣品中的克倫特羅含量，結(jié)果符合實驗規(guī)律。其中，理論上不應(yīng)檢測出克倫特羅的陰性樣品中也檢測出了微量鹽酸克倫特羅，這可能是因為包被抗原和酶標(biāo)抗體結(jié)合的時間或溫度不夠，包被抗原未能全部與酶標(biāo)抗體結(jié)合，導(dǎo)致檢測結(jié)果高于理論值。3.2百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測圖2檢測卡檢測結(jié)果實驗結(jié)果表明，陽性樣品顯示了一條線，含有鹽酸克倫特羅，陰性樣品顯示了兩條線不含鹽酸克倫特羅。結(jié)果符合實驗規(guī)律。4討論4.1克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測法的原理是什么？在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原；加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的克倫特羅與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)記的克倫特羅單克隆抗體，游離的酶標(biāo)記抗體通過洗滌被除去；再加入顯色液，結(jié)合的酶標(biāo)記抗體使無色的顯色液轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，加入反應(yīng)終止液后再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450nm處測量，樣品吸光值與樣品中克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣品中克倫特羅含量。4.2克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測法有什么優(yōu)缺點？在免疫分析法中，ELISA是一種將抗體、抗原的特異反應(yīng)與酶底物的高效催化作用相結(jié)合起來的高敏感性分析方法，具有特異性強、便于大規(guī)模檢查及適合現(xiàn)場和基層使用等特點ADDINNE.Ref.{7A161547-480E-4634-B51A-329A4C0BE3DE}[2]，是臨床診斷和免疫檢測的常用方法。但同其他免疫診斷方法一樣，酶免試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性顯色的問題ADDINNE.Ref.{53CC5EF5-E664-492D-8B12-109E34F06343}[3]，導(dǎo)致實驗結(jié)果不夠準(zhǔn)確。4.3如何改進(jìn)克倫特羅(瘦肉精)直接競爭ELISA檢測法？ELISA檢測法最主要的問題是非特異性顯色，非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性（固相載體的選擇、包被物的純度、包被抗體的效價）、檢驗標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物（內(nèi)源干擾物及外源干擾物），操作過程中的問題等。對于試劑盒特異性的問題，可通過對使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證，評估、提高包被抗原的純度和選擇高親和力和高特異性的包被抗體來減少非特異性顯色；對于含酶標(biāo)記物的干擾物的問題，可通過控制樣品采集、貯存和處理的環(huán)境條件，避免樣品污染，從而減少非特異性顯色；對于操作過程中的問題，可通過鍛煉操作人員的實驗操作技術(shù)或用機器代替操作人員（如使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免樣品在加樣時出現(xiàn)的誤差）來減少非特異性顯色。另外，酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確，最好使用雙波長，一個檢測波長，一個參考波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的干擾ADDINNE.Ref.{AA086896-33F7-41E8-AFFF-7C74C0F9101C}[3]。4.4百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡檢測法的原理是什么？百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡根據(jù)競爭抑制免疫層析法設(shè)計，由測試端、顯色區(qū)和手柄端3部分構(gòu)成。測試端含有加樣纖維層和鹽酸克倫特羅金標(biāo)單抗纖維層;顯色區(qū)為硝酸纖維素膜層,其上含有判定檢測結(jié)果的檢測印跡和對照印跡,分別為鹽酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG多克隆抗體；手柄端內(nèi)含吸水材料層(圖3)。若待測樣品溶液中不含鹽酸克倫特羅,當(dāng)樣品溶液進(jìn)入測試端,鹽酸克倫特羅金標(biāo)單抗在硝酸纖維素膜上層析泳動,被硝酸纖維素膜上檢測印跡處的鹽酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物攔截形成鹽酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物—金標(biāo)鹽酸克倫特羅單抗復(fù)合物,并在該印跡處形成紅色的條帶(檢測線)；測試端多余的金標(biāo)鹽酸克倫特羅單抗在硝酸纖維素膜上繼續(xù)層析可被對照印跡羊抗鼠IgG單克隆抗體捕獲形成紅色的對照條帶(對照線)。當(dāng)待測尿樣中含有一定量的鹽酸克倫特羅時,鹽酸克倫特羅與鹽酸克倫特羅金標(biāo)單抗形成復(fù)合物,從而與硝酸纖維素膜上的鹽酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物形成競爭,抑制了檢測印跡處包被的鹽酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物捕獲鹽酸克倫特羅金標(biāo)單抗的量,而不能在檢測線形紅色印跡或形成顏色較淺的紅色印跡,多余的盒標(biāo)鹽酸克倫特羅單抗繼續(xù)層析在對照印跡處形成對照線ADDINNE.Ref.{40DCC84B-9075-4EDB-9B43-35F823D240E3}[4]。圖3鹽酸克倫特羅快速檢測卡原理圖4.5百睿TM鹽酸克倫特羅快速檢測卡什么優(yōu)缺點？對比ELISA檢測法，鹽酸克倫特羅快速檢測卡具有敏感、特異、快速、簡便的特點，靈敏度能夠達(dá)到臨床使用的要求,且無需任何儀器設(shè)備，在10min內(nèi)就能檢測出結(jié)果，適合現(xiàn)場快速檢測和篩選工作ADDINNE.Ref.{85C85B58-BDD1-46FE-BFA6-D025A62F1B34}[5]。但檢測卡只能判斷樣品中是否含有克倫特羅，不能準(zhǔn)確地檢測樣品中克倫特羅的含量。同時檢測卡的檢測結(jié)果受許多因素影響，如采樣時間、所留標(biāo)本時間長短、提供標(biāo)本者的飲食情況、以及檢測時的環(huán)境條件,都將影響檢測結(jié)果,尤其是尿液中樣本成分復(fù)雜,特別是在含有鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)相近的代謝物時,都將導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性ADDINNE.Ref.{9E20477A-B35A-4DBD-9397-96779312D157}[5]。ADDINNE.Bib參考文獻(xiàn)[1]董昕，王娟.鹽酸克倫特羅的殘留與食品安全[J].肉類研究.2006(12):37-39.[2]袁利鵬，盧倚群，孫遠(yuǎn)明，等.鹽酸克倫特羅抗體純化及直接競爭