常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)光譜分析技術(shù)電化學(xué)技術(shù)電泳技術(shù)層析技術(shù)離心技術(shù)自動(dòng)生化分析技術(shù)1常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)光譜分析技術(shù)1光譜分析概念：利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析方法2光譜分析概念：利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對發(fā)射光譜

火焰光度法、原子發(fā)射光譜法、熒光光譜法吸收光譜

紫外、可見光、紅外光及原子吸收分光光度法散光光譜

比濁法光譜分析技術(shù)3發(fā)射光譜光譜分析技術(shù)344556677分光光度技術(shù)的基本原理透光度與吸光度T=I/IOT%=T×100%A=-lgT=-lgI/IO=lgIO/I8分光光度技術(shù)的基本原理透光度與吸光度T=I/IO8Lambert-Beer定律A=KLC適用用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體ε（摩爾吸光系數(shù)）：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時(shí)波長下的吸光度值9Lambert-Beer定律A=KLCε（摩爾吸光系數(shù)）：9分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源單色器比色杯檢測器顯示器10分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源10光源

光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，有足夠強(qiáng)度和穩(wěn)定性可見光分光光度計(jì)——鎢燈紫外光光度計(jì)——?dú)錈?1光源

光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，有足夠強(qiáng)度單色器將光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置濾光片棱鏡光柵12單色器將光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置12

比色杯玻璃或石英光徑為0.1~10cm,一般為1cm校準(zhǔn)13比色杯玻璃或石英13檢測器光信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)光電管及光電倍增管14檢測器光信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)14

顯示器檢流計(jì)、微安表、記錄器透光度和吸光度數(shù)字顯示器透光度和吸光度和濃度15顯示器檢流計(jì)、微安表、記操作方法開關(guān)——打開比色池蓋子——20分鐘預(yù)熱選定預(yù)定波長空白、校準(zhǔn)或待測液放入比色池，空白置于光路中開光于T位，打開比色池蓋子，粗、細(xì)調(diào)T為0.0關(guān)上比色蓋子，調(diào)T為100.0開關(guān)于A，用消光調(diào)零重復(fù)步驟4和5將校準(zhǔn)或待測液光路中測A16操作方法開關(guān)——打開比色池蓋子——20分鐘預(yù)熱16分光光度技術(shù)的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法條件變應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)品純且準(zhǔn)待測液吸光度超過線性范圍，應(yīng)稀釋再測待測液與標(biāo)準(zhǔn)曲線條件相同比較法

CU=(AU×CS)/AS17分光光度技術(shù)的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法17

火焰光度法(原子發(fā)射光譜)原理

標(biāo)本原子（基態(tài)）→激發(fā)態(tài)→釋放光能→不同原子有不同特征光譜線→濃度與發(fā)射光強(qiáng)度成正比鈉的特征譜線為589nm鉀的特征譜線為767nm18火焰光度法(原子發(fā)射光譜)原理18191920202121

溶液中帶電粒子在直流電場中向電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。

電泳22溶液中帶電粒子在直流電場中向電利用帶電粒子在電場作用下定向移動(dòng)的特性，對混合物組分進(jìn)行分離、純化和測定的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。電泳技術(shù)23利用帶電粒子在電場作用下定向移動(dòng)的特性，對混合

COO-

HCNH3+

R

COO-

HCNH2R

COOH

HCNH3+RH+H+OH-OH-pH=pIpH<pIpH>pI原理24COO-COO-人血清蛋白的等電點(diǎn)和電泳遷移率

蛋白質(zhì)等電點(diǎn)電泳遷移率cm2.s-1.v-1

白蛋白4.845.9×10-5

球蛋白5.065.1×10-5

球蛋白5.064.1×10-5

球蛋白5.122.8×10-5

球蛋白6.85~7.301.0×10-5

2525

電泳遷移率是帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的移動(dòng)速度。

即反映帶電粒子在每厘米降為1伏特（V/cm）的電場強(qiáng)度下每秒鐘內(nèi)移動(dòng)的厘米數(shù)（cm/s）。26電泳遷移率是帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的移動(dòng)速度。μ=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sμ為電泳遷移率，V為粒子移動(dòng)的速度（cm/s），即1/tE為電場強(qiáng)度（V/cm）T為時(shí)間（秒）1為移動(dòng)的距離（cm）μ為蛋白質(zhì)電泳的特征常數(shù)μ的單位為cm·s·v27μ=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sμ為電

電泳速度（V）與其電量（Q）和電場強(qiáng)度成正比，而與粒子的半徑（r）和介質(zhì)粘度系數(shù)（η）成反比，即

V=QE/6πrη

這樣

μ=V/E=Q/6πrη根據(jù)Stoke定律28電泳速度（V）與其電量（Q）和電場強(qiáng)度成正比，而與粒1、根據(jù)被分離的樣品多少分為

分析電泳

制備電泳

2、根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為

高壓電泳（50V/cm以上）常壓電泳（50V/cm以下）

電泳的分類291、根據(jù)被分離的樣品多少分為

分析電泳

3、根據(jù)電泳媒介的不同分為

自由電泳（溶液）區(qū)帶電泳（支持介質(zhì)）

4、根據(jù)電泳系統(tǒng)是否均一分為

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

303、根據(jù)電泳媒介的不同分為

自由電泳（溶液）

影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場強(qiáng)度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊31影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)31組成成分pHpH與pI比較，4.5-9.0,正極pH負(fù)極離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越大，緩沖容量越大，pH越穩(wěn)定，電泳速度越慢，標(biāo)本擴(kuò)散，產(chǎn)熱多，蒸發(fā)快；0.05-0.1mol/L3、緩沖液323、緩沖液325、蒸發(fā)作用6、樣品4、支持物吸附作用電滲作用335、蒸發(fā)作用4、支持物33

電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。

一、直流電源

一般由交流電經(jīng)過整流獲得

恒壓電源

恒流電源

恒功電源34電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。

一、直流二、電泳槽

蓋

電極及電極室

支架35二、電泳槽

蓋

電極及電極室

363637373838常用的區(qū)帶電泳濾紙電泳（PE已淘汰）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）瓊脂糖凝膠電泳（AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）39常用的區(qū)帶電泳濾紙電泳（PE已淘汰）3940404141電泳區(qū)帶的測定區(qū)帶染色溴酚藍(lán)、麗春紅（蛋白質(zhì)）PMS-NBT系統(tǒng)（同工酶）蘇丹紅、蘇丹黑（血漿脂蛋白）溴化乙啶（核酸）42電泳區(qū)帶的測定區(qū)帶染色42區(qū)帶定量

光密度掃描法洗脫比色法43區(qū)帶定量

光密度掃描法43SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳44SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4445454646474748484949不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用具有線性pH梯度的電泳介質(zhì)來分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)，這種電泳技術(shù)稱為等電聚焦電泳。50不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用具有線性pH梯度的進(jìn)行等電聚焦電泳的條件1.有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定的、重復(fù)性良好的pH梯度。

2.有一個(gè)抗對流的電泳材料。

3.電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶。51進(jìn)行等電聚焦電泳的條件1.有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定的、5

雙向電泳是先把樣品從一個(gè)方向進(jìn)行電泳分離，接著再與其成90°方向進(jìn)行第二次電泳分離。

第一次電泳以其電荷性質(zhì)為基礎(chǔ)；第二次電泳則按分子量不同進(jìn)行分離。52雙向電泳是先把樣品從一個(gè)方向進(jìn)行電泳分離，接著再與其

轉(zhuǎn)移電泳是將凝膠電泳的高分辯率與放射標(biāo)記或酶標(biāo)記等免疫化學(xué)方法的高靈敏度結(jié)合起來的電泳技術(shù)。53轉(zhuǎn)移電泳是將凝膠電泳的高分辯率與放射標(biāo)記或酶標(biāo)記等免545455555656

1.用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)或核酸

2.用電泳的方法將已分離的蛋白質(zhì)或核酸轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或重氮芐氨基甲基紙上。

3.鑒定紙上的蛋白質(zhì)或核酸

其方法步驟57

層析技術(shù)利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、極性、親和力、分配系數(shù)等）的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相，從而以不同速度移動(dòng)而分離。58層析技術(shù)利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小紙層析比移值（Rf）=溶質(zhì)譜帶中心移動(dòng)距離/流動(dòng)相前沿移動(dòng)的距離59紙層析比移值（Rf）=溶質(zhì)譜59凝膠層析60凝膠層析606161常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)光譜分析技術(shù)電化學(xué)技術(shù)電泳技術(shù)層析技術(shù)離心技術(shù)自動(dòng)生化分析技術(shù)62常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)光譜分析技術(shù)1光譜分析概念：利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析方法63光譜分析概念：利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對發(fā)射光譜

火焰光度法、原子發(fā)射光譜法、熒光光譜法吸收光譜

紫外、可見光、紅外光及原子吸收分光光度法散光光譜

比濁法光譜分析技術(shù)64發(fā)射光譜光譜分析技術(shù)3654665676687分光光度技術(shù)的基本原理透光度與吸光度T=I/IOT%=T×100%A=-lgT=-lgI/IO=lgIO/I69分光光度技術(shù)的基本原理透光度與吸光度T=I/IO8Lambert-Beer定律A=KLC適用用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體ε（摩爾吸光系數(shù)）：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時(shí)波長下的吸光度值70Lambert-Beer定律A=KLCε（摩爾吸光系數(shù)）：9分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源單色器比色杯檢測器顯示器71分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源10光源

光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，有足夠強(qiáng)度和穩(wěn)定性可見光分光光度計(jì)——鎢燈紫外光光度計(jì)——?dú)錈?2光源

光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，有足夠強(qiáng)度單色器將光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置濾光片棱鏡光柵73單色器將光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置12

比色杯玻璃或石英光徑為0.1~10cm,一般為1cm校準(zhǔn)74比色杯玻璃或石英13檢測器光信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)光電管及光電倍增管75檢測器光信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)14

顯示器檢流計(jì)、微安表、記錄器透光度和吸光度數(shù)字顯示器透光度和吸光度和濃度76顯示器檢流計(jì)、微安表、記操作方法開關(guān)——打開比色池蓋子——20分鐘預(yù)熱選定預(yù)定波長空白、校準(zhǔn)或待測液放入比色池，空白置于光路中開光于T位，打開比色池蓋子，粗、細(xì)調(diào)T為0.0關(guān)上比色蓋子，調(diào)T為100.0開關(guān)于A，用消光調(diào)零重復(fù)步驟4和5將校準(zhǔn)或待測液光路中測A77操作方法開關(guān)——打開比色池蓋子——20分鐘預(yù)熱16分光光度技術(shù)的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法條件變應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)品純且準(zhǔn)待測液吸光度超過線性范圍，應(yīng)稀釋再測待測液與標(biāo)準(zhǔn)曲線條件相同比較法

CU=(AU×CS)/AS78分光光度技術(shù)的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法17

火焰光度法(原子發(fā)射光譜)原理

標(biāo)本原子（基態(tài)）→激發(fā)態(tài)→釋放光能→不同原子有不同特征光譜線→濃度與發(fā)射光強(qiáng)度成正比鈉的特征譜線為589nm鉀的特征譜線為767nm79火焰光度法(原子發(fā)射光譜)原理18801981208221

溶液中帶電粒子在直流電場中向電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。

電泳83溶液中帶電粒子在直流電場中向電利用帶電粒子在電場作用下定向移動(dòng)的特性，對混合物組分進(jìn)行分離、純化和測定的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。電泳技術(shù)84利用帶電粒子在電場作用下定向移動(dòng)的特性，對混合

COO-

HCNH3+

R

COO-

HCNH2R

COOH

HCNH3+RH+H+OH-OH-pH=pIpH<pIpH>pI原理85COO-COO-人血清蛋白的等電點(diǎn)和電泳遷移率

蛋白質(zhì)等電點(diǎn)電泳遷移率cm2.s-1.v-1

白蛋白4.845.9×10-5

球蛋白5.065.1×10-5

球蛋白5.064.1×10-5

球蛋白5.122.8×10-5

球蛋白6.85~7.301.0×10-5

8625

電泳遷移率是帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的移動(dòng)速度。

即反映帶電粒子在每厘米降為1伏特（V/cm）的電場強(qiáng)度下每秒鐘內(nèi)移動(dòng)的厘米數(shù)（cm/s）。87電泳遷移率是帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的移動(dòng)速度。μ=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sμ為電泳遷移率，V為粒子移動(dòng)的速度（cm/s），即1/tE為電場強(qiáng)度（V/cm）T為時(shí)間（秒）1為移動(dòng)的距離（cm）μ為蛋白質(zhì)電泳的特征常數(shù)μ的單位為cm·s·v88μ=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sμ為電

電泳速度（V）與其電量（Q）和電場強(qiáng)度成正比，而與粒子的半徑（r）和介質(zhì)粘度系數(shù)（η）成反比，即

V=QE/6πrη

這樣

μ=V/E=Q/6πrη根據(jù)Stoke定律89電泳速度（V）與其電量（Q）和電場強(qiáng)度成正比，而與粒1、根據(jù)被分離的樣品多少分為

分析電泳

制備電泳

2、根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為

高壓電泳（50V/cm以上）常壓電泳（50V/cm以下）

電泳的分類901、根據(jù)被分離的樣品多少分為

分析電泳

3、根據(jù)電泳媒介的不同分為

自由電泳（溶液）區(qū)帶電泳（支持介質(zhì)）

4、根據(jù)電泳系統(tǒng)是否均一分為

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

913、根據(jù)電泳媒介的不同分為

自由電泳（溶液）

影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場強(qiáng)度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊92影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)31組成成分pHpH與pI比較，4.5-9.0,正極pH負(fù)極離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越大，緩沖容量越大，pH越穩(wěn)定，電泳速度越慢，標(biāo)本擴(kuò)散，產(chǎn)熱多，蒸發(fā)快；0.05-0.1mol/L3、緩沖液933、緩沖液325、蒸發(fā)作用6、樣品4、支持物吸附作用電滲作用945、蒸發(fā)作用4、支持物33

電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。

一、直流電源

一般由交流電經(jīng)過整流獲得

恒壓電源

恒流電源

恒功電源95電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。

一、直流二、電泳槽

蓋

電極及電極室

支架96二、電泳槽

蓋

電極及電極室

973698379938常用的區(qū)帶電泳濾紙電泳（PE已淘汰）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）瓊脂糖凝膠電泳（AGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）100常用的區(qū)帶電泳濾紙電泳（PE已淘汰）391014010241電泳區(qū)帶的測定區(qū)帶染色溴酚藍(lán)、麗春紅（蛋白質(zhì)）PMS-NBT系統(tǒng)（同工酶）蘇丹紅、蘇丹黑（血漿脂蛋白）溴化乙啶（核酸）103電泳區(qū)帶的測定區(qū)帶染色42區(qū)帶定量

光密度掃描法洗脫比色法104區(qū)帶定量

光密度掃描法43SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳105SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳441064510746108471094811049不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用