1.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

主要包括四個步驟：（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因導入受體細胞（4）目的基因的檢測與鑒定基因表達載體的構建基因工程的基本操作程序

主要包括四個步驟：（1）目一、目的基因的獲取2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術擴增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。一、目的基因的獲取2、獲取方法：1、目的基因：主要指的是編碼（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？基因文庫基（1）基因組文庫的構建模式圖通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因（1）基因組文庫的構建模式圖通過對以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，再反轉錄酶的催化下反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。（2）cDNA構建方法-----反轉錄法以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，再基因組DNA文庫cDNA文庫（3）基因組DNA文庫與cDNA文庫的構建基因組DNA文庫cDNA文庫（3）基因組DNA文庫與cDNA補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子

RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。終止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄。啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子①不能轉錄為信使RNA，不能：能轉錄相應的信使RNA，能補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶內(nèi)真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序結構基因外顯子內(nèi)含子轉錄、加工修飾mRNA結構基因外顯子內(nèi)含子轉錄、加工修飾mRNA原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______

區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫基因表達的計算在真核生物中，對應的是

的堿基數(shù)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉錄翻譯6 3 1氨基酸數(shù)堿基數(shù)？補充資料基因中外顯子基因表達的計算在真核生物中，對應的是思考：如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉錄產(chǎn)物mRNA；基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。注意：基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因。思考：依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；注（1）鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接受體細胞產(chǎn)生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)多用于原核生物（1）鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。多聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段②原理：__________DNA復制③前提條件：_______________________；有一段已知基因的核苷酸序列（二）利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈基因工程的基本操作程序培訓課程（二）利用PCR技術擴增目的基因（二）利用PCR技術擴增目的基因③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在_____作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈高溫③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、④原料：___________、___________、__________________、________________。⑤方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑥結果：四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量擴增模板DNA④原料：___________、___________、PCR的基本反應步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?CPCR總結：PCR的基本反應步驟變性延伸退火PCR總結：PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成（三）化學方法人工合成目的基因根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列人工合成(基因比較小，核苷酸序列已知)DNA合成儀人工合成(基因比較小，核苷酸序列已知)DNA合成儀從基因文庫中獲取利用PCR技術擴增利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法從基因文庫中獲取歸納：獲取目的基因的方法用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。用_____________切割目的基因，使其產(chǎn)生_______________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端或平末端同一種限制酶相同的黏性末端或平末端切口DNA連接酶1.過程:二、構建表達載體——

核心用一定的_________切割將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過程:質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶重組DN2.構建基因表達載體的目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2.構建基因表達載體的目的科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。資3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動思考1：

表達載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。思考1：

表達載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。思考3：標記基因有什么作用？是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DN三、將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。（一）轉化：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：有（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法（最多）基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（二）方法將目的基因導入將目的基因導入將目的基因導入農(nóng)桿菌轉1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法（1）農(nóng)桿菌轉化法特點：

①易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。（1）農(nóng)桿菌轉化法特點：②Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉移到③轉化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色體DNA表達新性狀轉入農(nóng)桿菌③轉化過程:Ti質(zhì)粒構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到常用法：常用菌：微生物作受體細胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因導入微生物細胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？用Ca2＋處理，增加細菌細胞膜的通透性Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少一定溫度重組表達載體DNA溶于緩沖液常用法：常用菌：微生物作受體細胞原因：過程：Ca2+處理大腸受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵體細胞受精卵細胞/個體農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞歸納：受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵四、目的基因的檢測與鑒定分子檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:個體生物學水平鑒定四、目的基因的檢測與鑒定分子檢測:1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（DNA-DNA)（2）過程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和基因組DNA雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。（一）檢測1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先基因工程的基本操作程序培訓課程2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)①方法:分子雜交(mRNA-DNA)①方法:抗原-抗體雜交②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。②過程:從轉基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內(nèi)是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞類型步驟檢測內(nèi)容方法結果顯示分子檢測第一步是否成功顯示出雜交帶第二步是否成功顯示出雜交帶第三步是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定

包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達和檢測轉基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交（DNA和DNA之間）目的基因是否轉錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交類型步驟檢測內(nèi)容方法結果顯示分子檢測第一步是否成功顯示出雜交提示：

①DNA分子雜交技術首先提取轉基因生物的DNA，然后高溫或提高pH解成單鏈，再與同位素標記的DNA探針雜交；

②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達出的蛋白質(zhì)注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應的抗體，并提取出來的。提示：基因工程的基本操作程序培訓課程歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞Ca2+處理（微生物）、農(nóng)桿菌轉化法（植物）、顯微注射法（動物）目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯個體生物學水平的鑒定歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？

不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子（增強基因啟動子工作效率的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；（5）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動1、為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。1、為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不2根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理,你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因不能導入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因導入小麥中,理論上講你應該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導的物質(zhì)，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的誘導的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。酚類誘導物主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中2根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理,你能分析出3、利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。3、利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構建成一個表達載體。（3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養(yǎng)進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！1.2基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

主要包括四個步驟：（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因導入受體細胞（4）目的基因的檢測與鑒定基因表達載體的構建基因工程的基本操作程序

主要包括四個步驟：（1）目一、目的基因的獲取2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術擴增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。一、目的基因的獲取2、獲取方法：1、目的基因：主要指的是編碼（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？基因文庫基（1）基因組文庫的構建模式圖通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因（1）基因組文庫的構建模式圖通過對以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，再反轉錄酶的催化下反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。（2）cDNA構建方法-----反轉錄法以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，再基因組DNA文庫cDNA文庫（3）基因組DNA文庫與cDNA文庫的構建基因組DNA文庫cDNA文庫（3）基因組DNA文庫與cDNA補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子

RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。終止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄。啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子①不能轉錄為信使RNA，不能：能轉錄相應的信使RNA，能補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶內(nèi)真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序結構基因外顯子內(nèi)含子轉錄、加工修飾mRNA結構基因外顯子內(nèi)含子轉錄、加工修飾mRNA原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______

區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫基因表達的計算在真核生物中，對應的是

的堿基數(shù)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉錄翻譯6 3 1氨基酸數(shù)堿基數(shù)？補充資料基因中外顯子基因表達的計算在真核生物中，對應的是思考：如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉錄產(chǎn)物mRNA；基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。注意：基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因。思考：依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；注（1）鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接受體細胞產(chǎn)生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)多用于原核生物（1）鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。多聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段②原理：__________DNA復制③前提條件：_______________________；有一段已知基因的核苷酸序列（二）利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈基因工程的基本操作程序培訓課程（二）利用PCR技術擴增目的基因（二）利用PCR技術擴增目的基因③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在_____作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈高溫③過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、④原料：___________、___________、__________________、________________。⑤方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑥結果：四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量擴增模板DNA④原料：___________、___________、PCR的基本反應步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?CPCR總結：PCR的基本反應步驟變性延伸退火PCR總結：PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成（三）化學方法人工合成目的基因根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列人工合成(基因比較小，核苷酸序列已知)DNA合成儀人工合成(基因比較小，核苷酸序列已知)DNA合成儀從基因文庫中獲取利用PCR技術擴增利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法從基因文庫中獲取歸納：獲取目的基因的方法用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。用_____________切割目的基因，使其產(chǎn)生_______________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端或平末端同一種限制酶相同的黏性末端或平末端切口DNA連接酶1.過程:二、構建表達載體——

核心用一定的_________切割將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過程:質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶重組DN2.構建基因表達載體的目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2.構建基因表達載體的目的科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。資3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動思考1：

表達載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。思考1：

表達載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。思考3：標記基因有什么作用？是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DN三、將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。（一）轉化：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：有（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法（最多）基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（二）方法將目的基因導入將目的基因導入將目的基因導入農(nóng)桿菌轉1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法（1）農(nóng)桿菌轉化法特點：

①易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。（1）農(nóng)桿菌轉化法特點：②Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉移到③轉化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色體DNA表達新性狀轉入農(nóng)桿菌③轉化過程:Ti質(zhì)粒構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到常用法：常用菌：微生物作受體細胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因導入微生物細胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？用Ca2＋處理，增加細菌細胞膜的通透性Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少一定溫度重組表達載體DNA溶于緩沖液常用法：常用菌：微生物作受體細胞原因：過程：Ca2+處理大腸受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵體細胞受精卵細胞/個體農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞歸納：受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵四、目的基因的檢測與鑒定分子檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:個體生物學水平鑒定四、目的基因的檢測與鑒定分子檢測:1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（DNA-DNA)（2）過程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和基因組DNA雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。（一）檢測1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先基因工程的基本操作程序培訓課程2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)①方法:分子雜交(mRNA-DNA)①方法:抗原-抗體雜交②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。②過程:從轉基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內(nèi)是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞類型步驟檢測內(nèi)容方法結果顯示分子檢測第一步是否成功顯示出雜交帶第二步是否成功顯示出雜交帶第三步是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定

包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達和檢測轉基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交（DNA和DNA之間）目的基因是否轉錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交類型步驟檢測內(nèi)容方法結果顯示分子檢測第一步是否成功顯示出雜交提示：

①DNA分子雜交技術首先提取轉基因生物的DNA，然后高溫或提高pH解成單鏈，再與同位素標記的DNA探針雜交；

②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用