第八章發(fā)酵過程控制第1頁，共284頁。發(fā)酵過程控制是發(fā)酵的重要部分控制難點(diǎn)：過程的不確定性和參數(shù)的非線性第2頁，共284頁。同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會(huì)得到不同的結(jié)果可見發(fā)酵過程的影響因素是復(fù)雜的第3頁，共284頁。比如設(shè)備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時(shí)間的長(zhǎng)短，發(fā)酵過程的細(xì)微差別都會(huì)引起微生物代謝的不同。了解和掌握分析發(fā)酵過程的一般方法對(duì)于控制代謝是十分必要的第4頁，共284頁。第一節(jié)發(fā)酵過程工藝控制的目的、研究的方法和層次一發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第5頁，共284頁。二發(fā)酵過程工藝控制的目的有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長(zhǎng)的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率第6頁，共284頁。發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點(diǎn)菌種本身的代謝特點(diǎn)生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性溫度、pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等第7頁，共284頁。比如糖代謝產(chǎn)生的中間物可能用作合成菌體的前體，可能用作合成產(chǎn)物的前體，也可能合成副產(chǎn)物，而這些前體有可能流向不同的反應(yīng)方向，環(huán)境條件的差異會(huì)引發(fā)代謝朝不同的方向進(jìn)行。微生物代謝是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，它的代謝呈網(wǎng)絡(luò)形式第8頁，共284頁。微生物的生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成有密切相關(guān)性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長(zhǎng)正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。特別是對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成更具有復(fù)雜性因此對(duì)發(fā)酵過程的了解不能機(jī)械的，割裂的去認(rèn)識(shí)，而要從分子水平、細(xì)胞代謝水平和反應(yīng)工程水平全面的認(rèn)識(shí)第9頁，共284頁。發(fā)酵過程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運(yùn)輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。第10頁，共284頁。為了全面的認(rèn)識(shí)發(fā)酵過程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過程的基本方面，在此基礎(chǔ)上再舉一些例子，說明如何綜合分析發(fā)酵過程及進(jìn)行優(yōu)化放大。第11頁，共284頁。三發(fā)酵過程研究的方法和層次1、研究方法單因子實(shí)驗(yàn)：對(duì)實(shí)驗(yàn)中要考察的因子逐個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)，尋找每個(gè)因子的最佳條件。一般用搖瓶做實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)一次可以進(jìn)行多種條件的實(shí)驗(yàn)，可以在較快時(shí)間內(nèi)得到的結(jié)果。缺點(diǎn)如果考察的條件多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)各因子之間可能會(huì)產(chǎn)生交互作用，影響的結(jié)果準(zhǔn)確性第12頁，共284頁。數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。如正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)。優(yōu)點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行多因子試驗(yàn)。用少量的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過數(shù)理分析得到單因子實(shí)驗(yàn)同樣的結(jié)果，甚至更準(zhǔn)確，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。但對(duì)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確性高，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法算出來的，如果實(shí)驗(yàn)中存在較大的誤差就會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)果。第13頁，共284頁。初級(jí)層次的研究：一般在搖瓶規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。主要考察目的菌株生長(zhǎng)和代謝的一般條件，如培養(yǎng)基的組成、最適溫度、最適pH等要求。搖瓶研究的優(yōu)點(diǎn)是工作量大，可以一次試驗(yàn)幾十種甚至幾百種條件，對(duì)于菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化有較高的效率。2、研究的層次第14頁，共284頁。代謝及工程參數(shù)層次研究：一般在小型反應(yīng)器規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。在搖瓶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察溶氧、攪拌等搖瓶上無法考察的參數(shù)，以及在反應(yīng)器中微生物對(duì)各種營養(yǎng)成分的利用速率、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物合成速率及其它一些發(fā)酵過程參數(shù)的變化，找出過程控制的最佳條件和方式。由于罐發(fā)酵中全程參數(shù)的是連續(xù)的，所以得到的代謝情況比較可信。第15頁，共284頁。除了裝備有常規(guī)發(fā)酵罐的溫度、溶氧、pH電極，得到發(fā)酵全過程的這些參數(shù)外，還有罐體稱重，補(bǔ)料計(jì)量裝置和尾氣采集分析系統(tǒng)，更重要的是，有一套獨(dú)特的數(shù)據(jù)處理軟件，可以得到14個(gè)發(fā)酵過程參數(shù)，并且可以輸入和繪制人工測(cè)定的參數(shù)，對(duì)發(fā)酵過程的分析起到了重要的作用全參數(shù)發(fā)酵罐第16頁，共284頁。生產(chǎn)規(guī)模放大：在大型發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。將小型發(fā)酵罐的優(yōu)化條件在大型反應(yīng)器上得以實(shí)現(xiàn),達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)。一般來說微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長(zhǎng)速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時(shí)間和分布不同，剪切力不同，滅菌時(shí)營養(yǎng)成分破壞程度不同所致。第17頁，共284頁。第二節(jié)發(fā)酵過程的中間分析發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因?yàn)槲⑸飩€(gè)體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。第18頁，共284頁。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因?yàn)樗鼈兎从嘲l(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等第19頁，共284頁。物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：第20頁，共284頁。發(fā)酵過程參數(shù)直接參數(shù):通過傳感器把非電量變化直接轉(zhuǎn)化為電量變化，實(shí)時(shí)地送計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集。物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)、生物量參數(shù)就地測(cè)量（inline）、在線測(cè)量（online）間接參數(shù):

由一些直接參數(shù)計(jì)算得到的各種反映過程特性的參數(shù)。反映菌體代謝活性、反應(yīng)器工程特性、反應(yīng)器操作特性…等。手工參數(shù):

取樣后實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)量參數(shù)，離線輸入。第21頁，共284頁。

直接參數(shù)

物理參數(shù)化學(xué)參數(shù)成熟不成熟第22頁，共284頁。

間接參數(shù)第23頁，共284頁。從檢測(cè)手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測(cè)得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計(jì)算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa等第24頁，共284頁。直接參數(shù)又可分為在線檢測(cè)參數(shù)和離線檢測(cè)參數(shù)在線檢測(cè)參數(shù)指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速；離線檢測(cè)參數(shù)指取出樣后測(cè)定得到的參數(shù)，如殘?zhí)恰H2-N、菌體濃度。第25頁，共284頁。一發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目目前發(fā)酵過程主要分析項(xiàng)目如下1、pHpH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)——酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況第26頁，共284頁。2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵排氣氧的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長(zhǎng)的活性，通過計(jì)算可以求得攝氧率（OUR）。排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況，因?yàn)槲⑸飻z入的氧并不是全部變成二氧化碳的，有的進(jìn)入代謝中間物分子，進(jìn)入細(xì)胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機(jī)物降解后會(huì)產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。第27頁，共284頁。RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長(zhǎng)階段的不同而不同。測(cè)定RQ值一方面可以了解微生物代謝的狀況，另一方面也可以指導(dǎo)補(bǔ)料CER表示單位體積發(fā)酵液?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)釋放的二氧化碳的量呼吸熵＝呼吸熵反映了氧的利用狀況第28頁，共284頁。對(duì)于這種工藝，后期的補(bǔ)料控制是關(guān)鍵。過程中發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)糖開始時(shí)，不但CER、OUR大幅度提高，連RQ也提高約10％，表明通過補(bǔ)糖不但提供了更多的碳源，而且隨著體系內(nèi)葡萄糖濃度提高，糖代謝相關(guān)酶活力也提高，產(chǎn)能增加。一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。第29頁，共284頁。3、糖含量菌體生長(zhǎng)旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每焱ㄟ^糖含量的測(cè)定，可以控制菌體生長(zhǎng)速率，可控制補(bǔ)糖來調(diào)節(jié)pH，促進(jìn)產(chǎn)物合成，不致于盲目補(bǔ)糖，造成發(fā)酵不正常。微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。反映產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖情況反映產(chǎn)物合成的活力糖的消耗：第30頁，共284頁。糖含量測(cè)定包括總糖和還原糖。

總糖指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。

還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。第31頁，共284頁。4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機(jī)氮中的氮（NH2-N），單位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機(jī)氮。氨氮指無機(jī)氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌體生長(zhǎng)情況，含氮產(chǎn)物合成情況。第32頁，共284頁。但是氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時(shí)采取補(bǔ)氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時(shí)就要放罐，否則影響提取過程第33頁，共284頁。5、磷含量微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計(jì)算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進(jìn)糖代謝。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補(bǔ)磷措施。第34頁，共284頁。菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長(zhǎng)的情況。菌形態(tài)顯微鏡觀察菌濃度的測(cè)定是衡量產(chǎn)生菌在整個(gè)培養(yǎng)過程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長(zhǎng)很快，中期菌濃基本恒定。補(bǔ)料會(huì)引起菌濃的波動(dòng)，這也是衡量補(bǔ)料量適合與否的一個(gè)參數(shù)。6、菌濃度和菌形態(tài)第35頁，共284頁。菌濃測(cè)定方法測(cè)粘度壓縮體積法（離心）靜置沉降體積法光密度測(cè)定法OD600~660適合于細(xì)菌、酵母第36頁，共284頁。7、產(chǎn)物濃度

在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測(cè)定來了解產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。而且通過計(jì)算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補(bǔ)料、pH對(duì)產(chǎn)物形成的影響。第37頁，共284頁。二產(chǎn)物量的測(cè)定（一）產(chǎn)物量的特殊表示法1、抗生素效價(jià)的表示抗生素效價(jià)表示抗生素的有效成分的多少，效價(jià)大小用單位（U）來表示效價(jià)表示方法：重量折算法重量單位類似重量單位特殊單位第38頁，共284頁。重量折算單位：以最低抑菌濃度為一個(gè)單位，如青霉素0.6微克＝1U重量單位：規(guī)定某些抗生素活性部分1μg=1u如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分1μg＝1u第39頁，共284頁。類似重量單位：規(guī)定抗生素的某種鹽1mg=1000u如金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定一為1μg＝1u特殊單位：藥檢所制定某些抗生素的單位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第40頁，共284頁。2、酶活力的表示法酶活力用單位來表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來表示酶的量。同一種酶用不同的方法測(cè)定會(huì)有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強(qiáng)度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個(gè)活性單位。第41頁，共284頁。（二）產(chǎn)物量的測(cè)定1、化學(xué)法（1）滴定法產(chǎn)物能使一定指示劑變色來指示反應(yīng)終點(diǎn)的可用滴定法如青霉素在堿性條件下加入過量的I2，反應(yīng)生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可計(jì)算出青霉素的單位檸檬酸可以用NaOH滴定來計(jì)算檸檬酸產(chǎn)量第42頁，共284頁。（2）比色法產(chǎn)物經(jīng)一定化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測(cè)定。淀粉酶活力測(cè)定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所釋放出的麥芽糖與生色試劑（3，5-二硝基水楊酸與酒石酸鉀鈉的堿溶液）產(chǎn)生顏色，它在540nm處所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第43頁，共284頁。（3）測(cè)壓法產(chǎn)物特定反應(yīng)放出或攝入氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測(cè)定壓力變化得知產(chǎn)物量。2、物理法許多酶、抗生素都有不對(duì)稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過測(cè)定旋光度來測(cè)定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第44頁，共284頁?；瘜W(xué)和物理方法優(yōu)點(diǎn)：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析缺點(diǎn)產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，因此抗生素成品的測(cè)定用生物法測(cè)定。

適用于抗生素效價(jià)的測(cè)定

生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，其原理恰好與臨床應(yīng)用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。但此法得到結(jié)果比較慢，需經(jīng)過16~18小時(shí)培養(yǎng)。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價(jià)的測(cè)定。3、生物法第45頁，共284頁。常用的生物法測(cè)定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被測(cè)抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑為6mm，高10mm的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。碟是攤布培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。操作方法是：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15ml（下層），待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到500C左右混入試驗(yàn)菌，將混有菌的培養(yǎng)基5ml加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。第46頁，共284頁。在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，在杯中加入待檢樣品，加滿后在370C培養(yǎng)16~18小時(shí)。在培養(yǎng)中,一方面試驗(yàn)菌開始生長(zhǎng)另一方面抗生素呈球面擴(kuò)散，離杯越近，抗生素濃度越大，離杯越遠(yuǎn)抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長(zhǎng)，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”?？股貪舛仍礁撸志υ酱?，第47頁，共284頁。r:抑菌圈的半徑(毫米）M：抗生素在管中的量（單位）C：最低抑菌濃度（單位/毫升）H：培養(yǎng)基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的擴(kuò)散系數(shù)（毫米/小時(shí)）T：細(xì)菌生長(zhǎng)到肉眼所用的時(shí)間（小時(shí)）第48頁，共284頁?？股貪舛扰c抑菌圈的半徑成一定數(shù)學(xué)關(guān)系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈半徑的平方呈正比。此外還受C、H、D、T的影響但是C、H、D、T是無法測(cè)量的，在實(shí)際計(jì)算中要設(shè)法消去第49頁，共284頁。一般的消去方法有二劑量法標(biāo)準(zhǔn)曲線法第50頁，共284頁。標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)點(diǎn)：在一個(gè)碟子上可以同時(shí)做兩個(gè)樣品的效價(jià)，當(dāng)要做的樣品量大時(shí)，采取標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以提高效率。假設(shè)選用的濃度為：3U，4U，5U，6U,7U中心點(diǎn)是5U1122第51頁，共284頁。每個(gè)濃度做三個(gè)碟子。5U為中心點(diǎn)，每個(gè)碟子中有3個(gè)杯中加中心點(diǎn)濃度，其余3個(gè)加其它濃度。測(cè)得抑菌圈后，將濃度和抑菌圈平均直徑做標(biāo)準(zhǔn)曲線。第52頁，共284頁。logMr第53頁，共284頁。管碟法影響因素的討論：斜率小D、T大,誤差小截距小C、D、T、H小，誤差小第54頁，共284頁。logMrlogM1r1r1r1第55頁，共284頁。培養(yǎng)基厚度H越小，其它條件相同時(shí)r越大。影響H的因素：培養(yǎng)基的厚度細(xì)菌生長(zhǎng)到肉眼所需的時(shí)間T越大在其它條件相同時(shí)，r越大影響T的因素：菌體本身，及影響菌體生長(zhǎng)的條件如：接種量，培養(yǎng)溫度、及營養(yǎng)環(huán)境其它影響因素：上層鋪得平整、菌液加入時(shí)的溫度、鋼圈的放置、滴液第56頁，共284頁。1、分批發(fā)酵簡(jiǎn)單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個(gè)過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。第57頁，共284頁。分批培養(yǎng)中微生物的生長(zhǎng)遲滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期死亡期第58頁，共284頁。微生物生長(zhǎng)分為：遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期在遲滯期，菌體沒有分裂只有生長(zhǎng)，因?yàn)楫?dāng)菌種接種入一個(gè)新的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋，這時(shí)細(xì)胞不能分裂。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，細(xì)胞開始分裂，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)很快，比生長(zhǎng)速率幾近常數(shù)。這個(gè)時(shí)期稱為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第59頁，共284頁。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，進(jìn)入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進(jìn)入死亡期對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期就開始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期大量合成。第60頁，共284頁。分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點(diǎn)產(chǎn)率低，不適于測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)第61頁，共284頁。2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點(diǎn)。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時(shí)有所增加。在工廠的實(shí)際生產(chǎn)中采用這種方法很多。第62頁，共284頁。補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點(diǎn)由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)第63頁，共284頁。3、半連續(xù)培養(yǎng)在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點(diǎn)代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大第64頁，共284頁。4、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。第65頁，共284頁。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長(zhǎng)，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)缺點(diǎn)菌種不穩(wěn)定的話，長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)料染菌機(jī)會(huì)大大增加。第66頁，共284頁。第四節(jié)發(fā)酵過程的pH控制

pH是微生物代謝的綜合反映，又影響代謝的進(jìn)行，所以是十分重要的參數(shù)。發(fā)酵過程中pH是不斷變化的，通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否第67頁，共284頁。一、發(fā)酵過程pH變化的原因

1、基質(zhì)代謝

（1）糖代謝特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一（2）氮代謝當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降第68頁，共284頁。2、產(chǎn)物形成某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。

3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。

第69頁，共284頁。二、pH對(duì)發(fā)酵的影響例pH對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

林可霉素發(fā)酵開始，葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機(jī)酸被生產(chǎn)菌利用，pH上升。若不及時(shí)補(bǔ)糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制某些酶系，使林可霉素增長(zhǎng)緩慢，甚至停止。對(duì)照罐發(fā)酵66小時(shí)pH達(dá)7.93，以后維持在8.0以上至115小時(shí)，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。發(fā)酵15小時(shí)左右，pH值可以從消后的6.5左右下降到5.3，調(diào)節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。1、實(shí)例第70頁，共284頁。pH7.0t不調(diào)pH調(diào)pH效價(jià)pH第71頁，共284頁。例：培養(yǎng)基初始pH值對(duì)漆酶分泌的影響pH在4～7范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高第72頁，共284頁。2、pH對(duì)發(fā)酵的影響（1）pH影響酶的活性。當(dāng)pH值抑制菌體某些酶的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻（2）pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變，從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行

（3）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用

第73頁，共284頁。（4）pH影響代謝方向

pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時(shí)，則產(chǎn)生草酸。谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺第74頁，共284頁。3、pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響生長(zhǎng)合成pH對(duì)菌體生長(zhǎng)影響比產(chǎn)物合成影響小例青霉素：菌體生長(zhǎng)最適pH3.5~6.0,產(chǎn)物合成最適pH7.2~7.4四環(huán)素：菌體生長(zhǎng)最適pH6.0~6.8，產(chǎn)物合成最適pH5.8~6.0XpH四環(huán)素第75頁，共284頁。4、最佳pH的確定配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況pH對(duì)產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響第76頁，共284頁。pH對(duì)海藻糖水解酶產(chǎn)生的影響pH——菌濃

pH——酶活第77頁，共284頁。pH對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力的影響第78頁，共284頁。三、pH的控制

1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH。基礎(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5~6.82、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等3、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH第79頁，共284頁。在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。在補(bǔ)料與調(diào)pH沒有矛盾時(shí)采用補(bǔ)料調(diào)pH如（1）調(diào)節(jié)補(bǔ)糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來調(diào)節(jié)pH(2)當(dāng)NH2-N低，pH低時(shí)補(bǔ)氨水；當(dāng)NH2-N低，pH高時(shí)補(bǔ)(NH4)2SO44、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH第80頁，共284頁。PH調(diào)節(jié)的方法主要有下列幾種：添加碳酸鈣法氨水流加法尿素流加法5、不同調(diào)pH方法第81頁，共284頁。(1)添加碳酸鈣法采用生理酸性銨鹽作為氮源時(shí)，由于NH4+被菌體利用后，剩下的酸根引起發(fā)酵液PH值下降，在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，就能起到調(diào)節(jié)PH值的作用。但是，碳酸鈣的用量甚大，在操作上易引起染菌的危險(xiǎn)，此法一般不采用。第82頁，共284頁。(2)氨水流加法在發(fā)酵過程中根據(jù)PH值的變化流加氨水調(diào)節(jié)PH值，且作為氮源，供給NH4+。氨水價(jià)格便宜，來源容易。但是，氨水作用快，對(duì)發(fā)酵液的PH值波動(dòng)影響大，應(yīng)采用少量多次流加，以免造成PH值過高，抑制菌體生長(zhǎng)，或PH值過低，NH4+不足等現(xiàn)象。具體流加方法應(yīng)根據(jù)菌種特性、長(zhǎng)菌情況、耗糖情況等決定，一般控制PH值7.0～8.0，最好能夠采用自動(dòng)控制連續(xù)流加方法。第83頁，共284頁。(3)尿素流加法是目前國內(nèi)味精廠普遍采用的方法。以尿素作為氮源進(jìn)行流加調(diào)節(jié)PH值，由于PH值變化具有一定的規(guī)律性，易于操作控制。首先，由于通風(fēng)、攪拌和菌體尿酶作用使尿素分解放氨，使PH值上升；氨和培養(yǎng)基成分被菌體利用并形成有機(jī)酸等中間代謝產(chǎn)物，使PH值降低，這時(shí)就需要及時(shí)流加尿素，以調(diào)節(jié)PH值和補(bǔ)充氮源。當(dāng)流加尿素后，尿素被菌體尿酶分解放出氨使PH值上升，氨被菌體利用和形成代謝產(chǎn)物使PH值下降，再次進(jìn)行流加反復(fù)進(jìn)行維持一定的PH值。第84頁，共284頁。流加時(shí)除主要根據(jù)PH值得變化外，還應(yīng)考慮到菌體生長(zhǎng)、耗糖、發(fā)酵的不同階段來采取少量多次流加，維持PH值稍低些，以利長(zhǎng)菌。當(dāng)長(zhǎng)菌快，耗糖快，流加量可適當(dāng)多些，PH值可略高些，發(fā)酵后期以有利于促進(jìn)產(chǎn)谷氨酸，維持PH值7.2左右為好。當(dāng)殘?zhí)且押苌?，接近放罐，以不加或少加為好，以免造成浪費(fèi)和增加后工序提取的困難。第85頁，共284頁。不同pH值對(duì)菌體的形態(tài)影響很大，當(dāng)pH值高于7．5時(shí)，菌體易于老化，呈現(xiàn)球狀；當(dāng)pH值低于6．5時(shí)菌體同樣受抑制，易于老化。而在7．2左右時(shí)，菌體是處于產(chǎn)酸期，呈現(xiàn)長(zhǎng)的橢圓形；在6．9左右時(shí)，菌體處于生長(zhǎng)期，呈“八”字形狀并占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。第86頁，共284頁。pH6．9時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，pH7．15時(shí)，對(duì)菌體的產(chǎn)酸有利。因此，在發(fā)酵的產(chǎn)酸期產(chǎn)酸較高。采用階段pH控制模式進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值為7．15，到80h后pH值為7．25。產(chǎn)率22．27g·/L，產(chǎn)酸率提高12．23％。第87頁，共284頁。例：克拉維酸發(fā)酵中pH變換控制問題的提出：在pH低時(shí)菌體生長(zhǎng)受抑制，在高pH時(shí)克拉維酸要分解用2.5升罐進(jìn)行的不控制pH的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，前期由于微生物產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物和有機(jī)酸使pH降至6.5。在達(dá)到最高細(xì)胞濃度后，pH開始從6.5升至8.3。CA產(chǎn)量達(dá)最高水平時(shí)，pH不再升高。在發(fā)酵終止時(shí)，pH再次升至8.5。隨著pH升高，CA迅速分解。第88頁，共284頁。研究不同pH對(duì)發(fā)酵的影響分別配置pH為6.0，7.0，8.0的培養(yǎng)基測(cè)定菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成pH6.0時(shí)，生長(zhǎng)受抑制，產(chǎn)物降解少第89頁，共284頁。pH8.0時(shí)生長(zhǎng)良好產(chǎn)量低，產(chǎn)物降解pH7.0時(shí)的狀況第90頁，共284頁?？刂苝H7.0和8.0時(shí)，最高細(xì)胞濃度接近相同(約16％PMV)，但控制pH6．0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制。在2．5升生物反應(yīng)器內(nèi)，不控制pH時(shí)2．47μg／(m1·h)控制pH7.0時(shí)的產(chǎn)率3．37μg／(m1·h)最高控制pH8.0時(shí)，產(chǎn)率2．02μg／(m1‘h)在控制pH6．0時(shí)，CA產(chǎn)生被抑制,但降解少因此對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和CA產(chǎn)生最好將pH控制于7.0，但在控制pH7.0時(shí)，仍出現(xiàn)CA的迅速分解。第91頁，共284頁。由于CA生產(chǎn)的最適pH和減少CA分解的pH各不相同，因此在分批發(fā)酵中應(yīng)用了pH變換策略，使發(fā)酵pH由中性pH7．0變換為酸性pH6.0。在發(fā)酵前期，在細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)生CA期間控制pH7.0，4d后，當(dāng)CA產(chǎn)量達(dá)最高值時(shí)，變換pH為6.0，以減少CA分解。最高CA濃度可保持24h。由于改變pH，使CA分解速率明顯降低。第92頁，共284頁。第93頁，共284頁。pH控制是一項(xiàng)非常細(xì)致的工作，不僅考慮最佳pH值，而且要根據(jù)生長(zhǎng)階段考察對(duì)pH的要求。在pH控制中還要采用合適的調(diào)節(jié)方法?？偨Y(jié)第94頁，共284頁。小結(jié)發(fā)酵過程pH會(huì)發(fā)生變化變化原因基質(zhì)代謝產(chǎn)物形成菌體自溶第95頁，共284頁。對(duì)發(fā)酵的影響pHpH影響酶的活性pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離pH影響代謝方向pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響

第96頁，共284頁。pH的控制方式基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH

當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH

發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值選擇合適的pH調(diào)節(jié)劑第97頁，共284頁。從圖中可見，熱凝膠發(fā)酵菌體生長(zhǎng)和熱凝膠合成是非偶聯(lián)的，整個(gè)發(fā)酵過程可以分成兩個(gè)階段：前10h是菌體生長(zhǎng)期，之后熱凝膠開始合成，至發(fā)酵結(jié)束是熱凝膠合成期。在菌體生長(zhǎng)期，DO直線下降，培養(yǎng)液中的pH也迅速下降。10h左右，菌體質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，DO和pH降至最低點(diǎn)（5.4～5.6），菌體生長(zhǎng)結(jié)束。此后進(jìn)入熱凝膠合成期。試驗(yàn)兩階段的最適pH，見表第98頁，共284頁。穩(wěn)定期隨著pH降低，糖耗速率增加，生物量增加，但產(chǎn)物合成速率在pH5.6時(shí)達(dá)到最高。說明當(dāng)pH小于5.6以后微生物消耗的糖并非用于合成熱凝膠，而是合成菌體。第99頁，共284頁。一、溫度對(duì)生長(zhǎng)的影響不同微生物的生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求不同第100頁，共284頁。根據(jù)它們對(duì)溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應(yīng)于0～26度生長(zhǎng)，嗜溫菌適應(yīng)于15～43度生長(zhǎng)，嗜熱菌適應(yīng)于37～65度生長(zhǎng)，嗜高溫菌適應(yīng)于65度以上生長(zhǎng)第101頁，共284頁。在最適溫度下，微生物生長(zhǎng)迅速；超過最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內(nèi)微生物尚能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度非常緩慢，世代時(shí)間無限延長(zhǎng)。在最低和最高溫度之間，微生物的生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增加，超過最適溫度后，隨溫度升高，生長(zhǎng)速率下降，最后停止生長(zhǎng)，引起死亡。每種微生物對(duì)溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來表征第102頁，共284頁。微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。第103頁，共284頁。1、微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)有密切關(guān)系根據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型，細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài)，只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細(xì)胞的正常生理功能，使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關(guān)性的原理第104頁，共284頁。液晶狀態(tài)是指某些有機(jī)物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時(shí)的過渡狀態(tài)稱為液晶態(tài)。由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)的溫度稱為熔點(diǎn)，以T1表示；由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)的溫度稱為清亮點(diǎn)，以T2表示。T1與T2之間的溫度稱為液晶溫度范圍。什么是液晶狀態(tài)？第105頁，共284頁。那么為什么不同微生物對(duì)溫度的要求不同呢？根據(jù)細(xì)胞膜脂質(zhì)成分分析表明，不同最適溫度生長(zhǎng)的微生物，其膜內(nèi)磷脂組成有很大區(qū)別。嗜熱菌只含飽和脂肪酸，而嗜冷菌含有較高的不飽和脂肪酸。第106頁，共284頁。2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)人們采用二種方案來研究酶在低溫條件下的結(jié)構(gòu)完整性和催化功能：(1)通過自然或誘導(dǎo)突變，將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比；(2)對(duì)比同屬嗜熱、嗜溫及嗜冷菌的蛋白結(jié)構(gòu)通過對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析表明：嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強(qiáng)，酶結(jié)構(gòu)的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導(dǎo)產(chǎn)生催化作用第107頁，共284頁。由于其核糖體、酶類以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng)，蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì)，一方面是由于其核糖體對(duì)低溫的不適應(yīng)，翻譯過程中不能形成有效的起始復(fù)合物，另一方面是由于低溫下細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致氨基酸等內(nèi)容物的泄露。3、蛋白質(zhì)合成嗜冷菌具有在0℃合成蛋白質(zhì)的能力第108頁，共284頁。將大腸桿菌從370C突然轉(zhuǎn)移到100C條件時(shí)細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)合成一組冷休克蛋白，它們對(duì)低溫的生理適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)嗜冷酵母的冷休克反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)冷刺激后冷休克蛋白在很短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。耐冷菌由于生活在溫度波動(dòng)的環(huán)境中，它們必須忍受溫度的快速降低，這與它們產(chǎn)生的冷休克蛋白是密切相關(guān)的。4、合成冷休克蛋白低溫微生物適應(yīng)低溫的另一機(jī)制是合成冷休克蛋白第109頁，共284頁。三、溫度的影響與控制（一）溫度對(duì)發(fā)酵的影響1、溫度影響反應(yīng)速率發(fā)酵過程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。從阿累尼烏斯方程式可以看到dlnKr/dt=E/RT2

積分得E=E——活化能Kr——速率常數(shù)第110頁，共284頁。2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于300C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到350C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響基質(zhì)溶解度，氧在發(fā)酵液中的溶解度也影響菌對(duì)某些基質(zhì)的分解吸收。因此對(duì)發(fā)酵過程中的溫度要嚴(yán)格控制。第111頁，共284頁。（二）最適溫度的選擇1、根據(jù)菌種及生長(zhǎng)階段選擇微生物種類不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長(zhǎng)溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長(zhǎng)溫度為30～320C，青霉菌生長(zhǎng)溫度為300C。第112頁，共284頁。在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長(zhǎng)迅速；根據(jù)生長(zhǎng)階段選擇第113頁，共284頁。發(fā)酵中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。第114頁，共284頁。發(fā)酵后期產(chǎn)物合成能力降低，延長(zhǎng)發(fā)酵周期沒有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長(zhǎng)階段28℃，合成期26℃后期再升溫；黑曲霉生長(zhǎng)37℃，產(chǎn)糖化酶32～34℃。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長(zhǎng)溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)30～32℃，產(chǎn)酸34～37℃。最適溫度選擇要根據(jù)菌種與發(fā)酵階段做試驗(yàn)。第115頁，共284頁。例：林可霉素發(fā)酵的變溫培養(yǎng)問題的提出接種后10h左右已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后是10h左右的加速生長(zhǎng)期，在40h左右對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本完成，在50h左右轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期主要問題：如何維持適度的菌體濃度和延長(zhǎng)分泌期？適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度可以延緩菌體的衰老和維持相當(dāng)數(shù)量的有強(qiáng)生產(chǎn)能力的菌絲體存在根據(jù)生長(zhǎng)階段選擇溫度第116頁，共284頁。變溫培養(yǎng)的正交設(shè)計(jì)第117頁，共284頁。前60h按31℃控制，縮短了適應(yīng)期使發(fā)酵提前轉(zhuǎn)入生產(chǎn)階段，同時(shí)菌絲體已有相當(dāng)量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)60小時(shí)后將罐溫降至3O℃使與抗生素合成有關(guān)的酶的活性增強(qiáng)，抗生素分泌量有所增加，同時(shí)因分泌期的延長(zhǎng)有利于進(jìn)一步積累抗生素發(fā)酵進(jìn)入后期罐溫再回升至31℃使生產(chǎn)菌在生命的最后階段最大限度的合成和排出次級(jí)代謝產(chǎn)物。結(jié)論：第118頁，共284頁。2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時(shí)，溫度也該低些。因?yàn)闇囟雀郀I養(yǎng)利用快，會(huì)使菌過早自溶。第119頁，共284頁。菌生長(zhǎng)快，維持在較高溫度時(shí)間要短些；菌生長(zhǎng)慢，維持較高溫度時(shí)間可長(zhǎng)些。培養(yǎng)條件適宜，如營養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長(zhǎng)?？偟膩碚f，溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過反復(fù)實(shí)踐來定出最適溫度。3、根據(jù)菌生長(zhǎng)情況第120頁，共284頁。四、發(fā)酵過程引起溫度變化的因素（一）發(fā)酵熱Q發(fā)酵發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因。所謂發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。什么叫凈熱量呢？在發(fā)酵過程中產(chǎn)生菌分解基質(zhì)產(chǎn)生熱量，機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量，而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度上升。發(fā)酵熱大，溫度上升快，發(fā)酵熱小，溫度上升慢。第121頁，共284頁。1、生物熱Q生物在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。第122頁，共284頁。生物熱與發(fā)酵類型有關(guān)微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量，183千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?04.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)生22.6千焦耳熱量，9.6千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?3千焦以熱的形式釋放二個(gè)例子中轉(zhuǎn)化為高能化合物分別為63.7％和42.6％第123頁，共284頁。在培養(yǎng)初期，菌體處于適應(yīng)期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期，菌體已基本上停止繁殖，主要靠菌體內(nèi)的酶系進(jìn)行代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。培養(yǎng)過程中生物熱的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的時(shí)間性。生物的大小與呼吸作用強(qiáng)弱有關(guān)第124頁，共284頁。如果培養(yǎng)前期溫度上升緩慢說明菌體代謝緩慢，發(fā)酵不正常。如果發(fā)酵前期溫度上升劇烈，有可能染菌，此外培養(yǎng)基營養(yǎng)越豐富，生物熱也越大。第125頁，共284頁。2、攪拌熱Q攪拌在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計(jì)算：Q攪拌＝P×860×4186.8（焦耳/小時(shí)）P——攪拌軸功率4186.8——機(jī)械能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ?dāng)量電機(jī)功率P=E——額定電壓I——額定電流cosφ——功率因素，1千瓦時(shí)＝860×4186.8焦耳第126頁，共284頁。3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)

通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會(huì)帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計(jì)。4、輻射熱Q輻射發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過發(fā)酵熱的5％。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射第127頁，共284頁。（二）發(fā)酵熱的測(cè)定有二種發(fā)酵熱測(cè)定的方法。一種是用冷卻水進(jìn)出口溫度差計(jì)算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過測(cè)量冷卻水進(jìn)出口的水溫，再從水表上得知每小時(shí)冷卻水流量來計(jì)算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵＝GCm(T出－T進(jìn))Cm——水的比熱G——冷卻水流量另一種是根據(jù)罐溫上升速率來計(jì)算。先自控，讓發(fā)酵液達(dá)到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計(jì)算出發(fā)酵熱。第128頁，共284頁。因?yàn)闊嵝?yīng)決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化途徑無關(guān)，反應(yīng)的熱效應(yīng)可以用燃燒值來計(jì)算，特別是有機(jī)化合物，燃燒熱可以直接測(cè)定。反應(yīng)熱效應(yīng)等于反應(yīng)物的燃燒熱總和減去生成物的燃燒熱的總和。ΔH＝∑（△H）反應(yīng)物－∑（△H）產(chǎn)物如谷氨酸發(fā)酵中主要物質(zhì)的燃燒熱為：葡萄糖159555.9KJ/Kg谷氨酸15449.3KJ/Kg玉米漿12309.2KJ/Kg菌體20934KJ/Kg尿素10634.5KJ/Kg根據(jù)化合物的燃燒值估算發(fā)酵過程生物熱的近似值。第129頁，共284頁。五、利用溫度控制提高產(chǎn)量例1利用熱沖擊處理技術(shù)提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量背景：（1）酵母在比常規(guī)發(fā)酵溫度髙10～200C的溫度下經(jīng)受一段時(shí)間刺激后，胞內(nèi)海藻糖的含量顯著增加。（2）Lewis發(fā)現(xiàn)熱沖擊能提高細(xì)胞對(duì)鹽滲透壓的耐受力（3）Toshiro發(fā)現(xiàn)熱沖擊可使胞內(nèi)3－磷酸甘油脫氫酶的活力提高15～25％，并導(dǎo)致甘油產(chǎn)量提高第130頁，共284頁。實(shí)驗(yàn)：甘油發(fā)酵是在髙滲透壓環(huán)境中進(jìn)行的，因此可望通過熱沖擊來提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量正交條件A沖擊溫度（0C）40，45，50B開始時(shí)機(jī)（h）8，16，30C沖擊時(shí)間（分）15，30，60結(jié)果發(fā)酵16小時(shí)，450C沖擊30分鐘最佳，發(fā)酵96小時(shí)后甘油濃度提高32.6％，發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)見圖（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30min第131頁，共284頁。例2

重組大腸桿菌人Cu/Zn-SOD的高表達(dá)Lac啟動(dòng)子，用乳糖作誘導(dǎo)劑270C300C340C370CSOD49661427065904638比活8101471679526蛋白6.1299.709.7911.88OD6007.41

10.72

11.7824.77第132頁，共284頁。原因：1、乳糖被用于合成菌體和其它蛋白，減少了合成SOD的原料，隨著溫度升高，蛋白和菌濃都增加。2、高溫下可能SOD降解速率增加，雜蛋白增加3、低溫下由于比生長(zhǎng)速率低，質(zhì)粒脫落減少4、低溫下菌的衰老減緩，死亡率低第133頁，共284頁。小結(jié)微生物最適生長(zhǎng)溫度微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)有關(guān)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致微生物對(duì)溫度的要求與酶分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別有關(guān)，如蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性因素改變，活性位點(diǎn)關(guān)鍵區(qū)域氨基酸的取代，離子束縛作用(ionbinding)減弱，蛋白核心區(qū)域疏水作用下降等第134頁，共284頁。溫度對(duì)發(fā)酵的影響：溫度影響反應(yīng)速率溫度影響發(fā)酵方向最適溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段選擇根據(jù)培養(yǎng)條件選擇菌種的生長(zhǎng)情況第135頁，共284頁。發(fā)酵過程引起溫度變化的因素發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射生物熱的定義，產(chǎn)生的原因：基質(zhì)代謝。它與菌種、發(fā)酵類型、生長(zhǎng)階段、營養(yǎng)條件有關(guān)攪拌熱與攪拌功率有關(guān)發(fā)酵熱測(cè)定:冷卻容量燃燒熱第136頁，共284頁。思考題7.16根據(jù)微生物對(duì)溫度的依賴可分類成哪幾類微生物？7.17微生物對(duì)溫度要求不同的原理是什么？7.18發(fā)酵過程的溫度會(huì)不會(huì)變化？為什么7.19發(fā)酵熱的定義7.20生物熱的大小與哪些因素有關(guān)？7.21溫度對(duì)發(fā)酵有哪些影響？7.22發(fā)酵過程溫度的選擇有什么依據(jù)？第137頁，共284頁。

第六節(jié)染菌的防治發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長(zhǎng)繁殖什么是染菌？第138頁，共284頁。一、染菌的影響發(fā)酵過程污染雜菌，會(huì)嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計(jì)劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會(huì)影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量第139頁，共284頁。（一）染菌對(duì)發(fā)酵的影響生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時(shí)間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果第140頁，共284頁。1、發(fā)酵染菌對(duì)不同品種的影響放線菌由于生長(zhǎng)的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長(zhǎng)pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。不同菌不同產(chǎn)品第141頁，共284頁。鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會(huì)造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對(duì)細(xì)菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。不同產(chǎn)品第142頁，共284頁。疫苗生產(chǎn)危害很大。現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。不同產(chǎn)品第143頁，共284頁。2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響（1）污染噬菌體

噬菌體的感染力很強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。第144頁，共284頁。（2）污染其它雜菌有些雜菌會(huì)使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會(huì)反復(fù)染菌。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會(huì)反復(fù)染菌。第145頁，共284頁。3、不同時(shí)間染菌對(duì)發(fā)酵的影響污染時(shí)間是指用無菌檢測(cè)方法確準(zhǔn)的污染時(shí)間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時(shí)間。雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長(zhǎng)、繁殖的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時(shí)間又與污染菌量有關(guān)。第146頁，共284頁。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時(shí)間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時(shí)間就長(zhǎng)。第147頁，共284頁。（1）種子培養(yǎng)期染菌由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)一開始不占優(yōu)勢(shì)，而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。第148頁，共284頁。（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個(gè)時(shí)期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。第149頁，共284頁。（3）發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌會(huì)嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時(shí)甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時(shí)也會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施

降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第150頁，共284頁。（4）發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對(duì)生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。第151頁，共284頁。4、染菌程度對(duì)發(fā)酵的影響

染菌程度愈大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)量多，對(duì)發(fā)酵的危害愈大。當(dāng)生產(chǎn)菌已迅速繁殖，在發(fā)酵液中占有優(yōu)勢(shì)，污染極少數(shù)雜菌，如每1L中有1～2個(gè)雜菌，對(duì)發(fā)酵不會(huì)帶來影響，因?yàn)檫@些雜菌需要時(shí)間繁殖才能達(dá)到危害發(fā)酵的程度，而且環(huán)境對(duì)雜菌的繁殖已不利。當(dāng)75m3發(fā)酵液污染1個(gè)雜菌，要達(dá)到大幅度(106個(gè)/mL)污染時(shí)需要的時(shí)間(h)為：第152頁，共284頁。條件污染106個(gè)/mL污染108個(gè)/mL增代時(shí)間tg=30min2326延遲6htg=30min2932增代時(shí)間tg=2h92106延遲6htg=2h98112

但是污染幅度較大時(shí)，特別是發(fā)酵前期和中期污染，將造成嚴(yán)重的危害。第153頁，共284頁。（二）發(fā)酵染菌對(duì)提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1、發(fā)酵染菌對(duì)過濾的影響染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時(shí)不能或很難形成濾餅，導(dǎo)致過濾困難。即使采取加熱、冷卻、添加助濾劑等措施，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不理想。第154頁，共284頁。污染雜菌的種類對(duì)過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時(shí)，影響較小，而污染細(xì)菌時(shí)很難過濾。由于過濾困難，過濾時(shí)間拉長(zhǎng)，影響發(fā)酵液儲(chǔ)罐和過濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會(huì)因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提煉總收率。第155頁，共284頁。2、發(fā)酵染菌對(duì)提煉的影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純。采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時(shí)與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純。第156頁，共284頁。二、染菌的原因（一）發(fā)酵染菌率計(jì)算基準(zhǔn)總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應(yīng)包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染菌的批次數(shù)在內(nèi)。這是習(xí)慣的計(jì)算方法，也是我國的統(tǒng)一計(jì)算方法。總?cè)揪?=第157頁，共284頁?？梢哉f產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負(fù)責(zé)任”和“僥幸心理”所造成的。（二）染菌原因造成染菌的因素很多，但總結(jié)幾十年的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)絕大部分罐批染菌的原因是比較清楚的但在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高第158頁，共284頁。例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌；設(shè)備有滲漏不能進(jìn)罐等等都是眾所周知的，但因?yàn)橛袃e幸心理還是照樣滅菌，進(jìn)罐，結(jié)果以污染雜菌而告終?，F(xiàn)將收集到的國內(nèi)外幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因列于下：第159頁，共284頁。日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析項(xiàng)目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌

9.64接種時(shí)罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15原因不明24.94第160頁，共284頁。上海第三制藥廠染菌原因分析項(xiàng)目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78

第161頁，共284頁。管理不善而染菌的有31個(gè)罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因：

項(xiàng)目百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺乏驗(yàn)收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當(dāng)3.25第162頁，共284頁。第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析項(xiàng)目百分率%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)有菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足0.60管理問題7.80操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60原因不明35.00第163頁，共284頁。造成染菌的主要原因總結(jié)1、設(shè)備滲漏設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。第164頁，共284頁。所以說加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對(duì)制服染菌是極其主要的，也是重要的。從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對(duì)染菌原因分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85％，上海三廠的分析這類染菌為37.5％。第165頁，共284頁。2、空氣帶菌從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和26%。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因?yàn)榭諝獬到y(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會(huì)導(dǎo)致空氣除菌失敗。第166頁，共284頁。3、種子帶菌種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。加強(qiáng)種子管理，嚴(yán)格無菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。第167頁，共284頁。4、滅菌不徹底滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時(shí)間——產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將連續(xù)滅菌預(yù)熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計(jì)數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)2～3個(gè)芽孢桿菌。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。第168頁，共284頁。原材料儲(chǔ)存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料——雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量——有無滅菌的死角對(duì)減少或避免染菌仍然是十分必要的。

第169頁，共284頁。5、技術(shù)管理不善技術(shù)管理就是要對(duì)發(fā)酵每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理第170頁，共284頁。三、無菌狀況的檢測(cè)1、環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測(cè)無菌平板檢測(cè)第171頁，共284頁。2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測(cè)酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測(cè)平板劃線顯微鏡觀察第172頁，共284頁。四、染菌情況分析染菌的原因有多種，對(duì)于實(shí)際情況如何分析呢？1、單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效第173頁，共284頁。2、多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長(zhǎng)期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底3、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底第174頁，共284頁。4、中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，一般不會(huì)是種子問題第175頁，共284頁。五、染菌的防止1、防止種子帶菌制備種子時(shí)對(duì)沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時(shí)要多次間歇滅菌注意接種時(shí)的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。第176頁，共284頁。無菌室要求在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時(shí)，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺(tái)的通風(fēng)，接種時(shí)必須在超凈臺(tái)上操作，超凈臺(tái)裝有一臺(tái)鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)風(fēng)口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，保證無菌風(fēng)從超凈臺(tái)吹出，外界有菌空氣不可能進(jìn)入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。第177頁，共284頁。2、防止設(shè)備滲漏發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等原因會(huì)導(dǎo)致設(shè)備及附件滲漏。設(shè)備上一旦滲漏，就會(huì)造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會(huì)通過漏孔而進(jìn)入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會(huì)使帶菌的空氣或水進(jìn)入發(fā)酵罐而造成染菌。設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn)。第178頁，共284頁。水壓試漏法試漏方法集氣桶試漏法第179頁，共284頁。水壓試漏法。方法是被測(cè)設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水壓入設(shè)備，待設(shè)備中壓力上升到要求壓力，關(guān)閉進(jìn)出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，可以用稀堿溶液壓入設(shè)備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。閥門滲漏可以用集氣桶來試漏。方法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉所有閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力，一般一公斤以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。第180頁，共284頁。3、防止培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌方法——高壓蒸汽滅菌分批滅菌1210C，30分鐘連續(xù)滅菌罐溫125－1300C，30－45分鐘第181頁，共284頁。蒸汽下進(jìn)上出第182頁，共284頁。連續(xù)滅菌設(shè)備流程第183頁，共284頁。連消塔第184頁，共284頁。培養(yǎng)基滅菌前含有大量雜菌，滅菌時(shí)如果蒸汽壓力不足，就達(dá)不到要求的溫度；滅菌時(shí)產(chǎn)生大量泡沫或發(fā)酵罐中有污垢堆積，就會(huì)窩藏大量雜菌，造成滅菌不徹底。為什么蒸汽滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫呢？培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時(shí)升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。第185頁，共284頁。防止方法：緩慢開啟蒸汽閥門，或加入少量消泡劑。滅菌時(shí)還會(huì)因設(shè)備安裝或污垢堆積造成一些“死角”。這些死角蒸汽不能有效達(dá)到，常會(huì)窩藏耐熱芽孢桿菌.所以設(shè)備安裝要注意不能造成死角，發(fā)酵設(shè)備要經(jīng)常清洗，鏟除污垢。所以設(shè)備安裝要注意不能造成死角，發(fā)酵設(shè)備要經(jīng)常清洗，鏟除污垢。第186頁，共284頁。4、防止空氣引起的染菌空氣過濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)儲(chǔ)罐二級(jí)冷卻加熱器空氣過濾粗過濾第187頁，共284頁。空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會(huì)滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長(zhǎng)期使用后，棉花和活性炭的體積被壓縮而松動(dòng)，如果上下端棉花鋪得厚薄不均，厚的一邊阻力大空氣不暢通，薄的一邊空氣容易通過，久而久之，薄的一邊長(zhǎng)期受空氣頂吹而使棉花活性炭改變位置，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時(shí)，若被蒸汽冷凝水潤濕就會(huì)降低或喪失過濾效能，滅菌完畢應(yīng)立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。第188頁，共284頁。超細(xì)纖維紙作過濾介質(zhì)，滅菌時(shí)必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。在生產(chǎn)實(shí)踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過濾器，導(dǎo)致過濾介質(zhì)失效。第189頁，共284頁。5、發(fā)酵染菌后的措施染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌半小時(shí)，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會(huì)造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會(huì)造成空氣的污染而導(dǎo)致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，對(duì)癥下藥，該罐也要徹底清洗，進(jìn)行空罐消毒，才可進(jìn)罐。染菌厲害時(shí)，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。第190頁，共284頁。六、染噬菌體的防治（一）染噬菌體對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會(huì)反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進(jìn)行，甚至使種子全部喪失。第191頁，共284頁。1、鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴(yán)重時(shí)完全看不到菌體，且是在短時(shí)間內(nèi)菌體自溶。2、發(fā)酵pH值逐漸上升，4-8小時(shí)之內(nèi)可達(dá)8.0以上，不再下降。3、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多?、生產(chǎn)量甚少或增長(zhǎng)緩慢或停止有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗(yàn)染噬菌體表現(xiàn)為：第192頁，共284頁。（二）產(chǎn)生噬菌體的原因經(jīng)過1-2年以后，主要是由于生產(chǎn)和試驗(yàn)過程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，自然界中的噬菌體就在活菌體中大量生長(zhǎng)，造成了自然界中噬菌體增殖的好機(jī)會(huì)。通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體的危害第193頁，共284頁。這些噬菌體隨著風(fēng)沙塵土和空氣流動(dòng)傳播，以及人們的走動(dòng)、車輛的往來也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體有可能潛入生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進(jìn)入種子室、種子罐、發(fā)酵罐第194頁，共284頁。在培養(yǎng)皿上倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷疑染噬