關(guān)于瘧原蟲檢驗技術(shù)第一頁，共六十三頁，2022年，8月28日●分子生物學、血清學技術(shù)發(fā)展迅猛,但是確診瘧疾的“金標準”

仍然是血液顯微鏡檢查●顯微鏡檢查是唯一可鑒別4種瘧原蟲的方法●厚薄血涂片的檢查仍被認為是不可替代的瘧疾診斷的金標準實驗室技術(shù)第二頁，共六十三頁，2022年，8月28日厚薄血膜的制作

鏡檢技術(shù)—血片制作制作血片前，首先要核對患者的姓名和年齡第三頁，共六十三頁，2022年，8月28日取血部位和血量

取血方法采血部位：耳垂或無名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小。第四頁，共六十三頁，2022年，8月28日厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當遠的地方.將采血玻片(推片)的邊緣緊貼載玻片使血液沿邊緣散開(如圖示).第五頁，共六十三頁，2022年，8月28日正確的推片姿勢第六頁，共六十三頁，2022年，8月28日標準的瘧疾厚薄血膜片位置第七頁，共六十三頁，2022年，8月28日各種不同的瘧疾血片涂制法：標準血片門診發(fā)熱病人血片居民普查血片第八頁，共六十三頁，2022年，8月28日厚薄血膜的標準

●厚血膜血量適宜，不宜過多或過少●薄血膜平整,無皺折和空泡.紅細胞單層排列第九頁，共六十三頁，2022年，8月28日血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

常用吉氏染色法第十頁，共六十三頁，2022年，8月28日吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g

甘油(純)250ml

甲醇

(純)250ml●吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好?！裾麄€染色液配制時間不能少于5個小時第十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日稀釋吉氏原液●原液需經(jīng)緩沖液或凈水稀釋后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取母液時，不要晃動瓶子,以免沉淀物泛起影響染色效果.第十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日操作1（快染）

量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標本的厚薄血膜上，染色10min，清水細緩沖洗，晾干鏡檢。操作2(慢染)在量筒內(nèi)量2ml蒸餾水或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標本上，染色30~40min。清水細緩沖洗，晾干鏡檢。吉氏染液濃度門診染色第十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀釋液（3毫升吉氏原液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，同時對厚薄血膜染色30min（如染液不合標準時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將血片標本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包裝，鏡檢。成批血片染色第十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日質(zhì)量好的染色:

顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍色

如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍,說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標準第十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日染色過程血片平置于染色板上用吸管吸取已稀釋的吉氏液約2ml于厚薄血膜上，染色10min清水細緩輕輕沖去染液置玻片于插板上，自然晾干血片干燥后,用甲醇固定薄血膜第十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日血片制作注意事項

●載玻片必須清潔無油污，不然會影響血片制作和鏡檢結(jié)果．●用甲醇固定薄血膜時，甲醇不要接觸到厚血膜●血片充分干燥后染色，清水細緩沖洗。防止厚血膜脫落.●配置吉氏母液必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量．第十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日瘧原蟲密度計算計算瘧原蟲密度的三種方法：●白細胞原蟲密度計數(shù)法(厚血膜WHO)●半定量計數(shù)法(厚血膜)●紅細胞感染密度計算法(薄血膜)第十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日●在厚血膜按視野順序，從看到第一個瘧原蟲開始計數(shù)，記錄200個白細胞中的瘧原蟲數(shù)（可分有性體和無性體），如果原蟲密度較低，可增加白細胞計數(shù)500~1000個?！癜准毎懺x計算公式：瘧原蟲數(shù)÷計數(shù)的白細胞數(shù)×患者每微升血白細胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血?！袢绻恢颊叩陌准毎麛?shù)，則每微升血以8000個白細胞計數(shù)(國際標準)。白細胞瘧原蟲密度計數(shù)法第十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日白細胞瘧原蟲計數(shù)法舉例●假設(shè)計數(shù)200WBC中有35個瘧原蟲，在不知患者白細胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個白細胞計數(shù),由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為：35（瘧原蟲數(shù)）÷200（計數(shù)的白細胞）x8000（每微升血白細胞數(shù)）=1400/μl答：該患者的瘧原蟲密度為1400/μl。第二十頁，共六十三頁，2022年，8月28日用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估計出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點是計數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。國內(nèi)常用。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野1~5個蟲，記錄“＋”4.平均每個視野6~10個蟲，記錄“++”5.平均每個視野11~100個蟲，記錄“+++”6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“++++”。半定量計數(shù)法第二十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日薄血膜不同區(qū)域的紅細胞瘧原蟲感染率有較大差別，通常血膜后端和邊緣部瘧原蟲密度常比前半部或中央部高，所以，鏡檢時不宜只檢查一個角落，應順玻片的橫軸檢查。選擇紅細胞排列整齊密集，無重迭的視野鏡檢時，應當記錄下所觀察到的各種瘧原蟲蟲期，不要籠統(tǒng)地記錄為Pv或Pf。紅細胞瘧原蟲感染密度計算（薄血膜）第二十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日顯微鏡下（10目鏡Χ100油鏡）選擇紅細胞排列整齊密集，無重迭的視野（約300紅細胞/視野）紅細胞瘧原蟲密度按以下公式計算：1.紅細胞瘧原蟲感染率（%）計算紅細胞原蟲感染率（%）=瘧原蟲數(shù)÷計數(shù)的紅細胞數(shù)X1002.紅細胞瘧原蟲感染密度計算紅細胞瘧原蟲密度=紅細胞原蟲感染率X紅細胞數(shù)/每微升血（男性500萬個/μl；女性450萬個/μl）3.如果能見到瘧原蟲，但是記數(shù)10000個紅細胞時卻沒有感染紅細胞，那么設(shè)定感染率為＜１％

紅細胞感染率計算法（薄血膜）第二十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日如何確定瘧原蟲血片為陰性●檢查全部厚血膜未查見瘧原蟲●

最少檢查100個厚血膜油鏡視野未查見瘧原蟲第二十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日人類四種瘧原蟲的

基本特征第二十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日感染人的瘧原蟲有四種:

惡性瘧原蟲P.falciparum

間日瘧原蟲P.vivax三日瘧原蟲P.malariae

卵形瘧原蟲P.ovale

第二十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日惡性瘧P.falciparum

●

分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病●我國流行區(qū)域為云南省和海南省●四種瘧原蟲中致病力最強，無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時治療可危及生命第二十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日間日瘧

P.vivax

●間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū),主要是中部地區(qū)●病程良性,有復發(fā)●遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見第二十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日三日瘧

P.malariae

遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報告無復發(fā)卵形瘧P.ovale又稱蛋形瘧原蟲,主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報告在我國已基本消滅癥狀與間日瘧相似,有復發(fā)第二十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日四種瘧原蟲的

形態(tài)特征

第三十頁，共六十三頁，2022年，8月28日紅細胞不漲大環(huán)狀體釬細,一個紅細胞內(nèi)可有幾個環(huán)狀體,環(huán)狀體內(nèi)可有2個核

環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣

血片中沒有其他發(fā)育期滋養(yǎng)體配子體呈新月形或臘腸形成熟裂殖體約含6-32個裂殖子可出現(xiàn)茂氏點惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點第三十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日紅細胞通常漲大薛氏點明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個裂殖子

間日瘧（P.vivax）鑒定要點第三十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日紅細胞不漲大或略小環(huán)狀體可呈方形胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個裂殖子

核可能出現(xiàn)在環(huán)狀體邊緣

三日瘧（P.malariae）診斷要點第三十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日卵形瘧（P.ovale）診斷要點紅細胞漲大

常見慧星狀(也稱齒輪狀)環(huán)粗大薛氏點明顯

成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大成熟裂殖體約含4-12個裂殖子

第三十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日種周圍血中發(fā)育階段紅細胞形態(tài)瘧原蟲形態(tài)大小點彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲環(huán)狀體配子體正常常見茂氏點環(huán)狀體釬細，常見２個核粗黑，配子體中明顯6-32

平均=10-24間日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體漲大,可達正常的1.5-2倍薛氏點可出現(xiàn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍色，活潑金棕色不明顯12-24平均

=16卵形瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體漲大,可達正常的

1.25-1.5倍薛氏點可出現(xiàn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍色較深，核較大深棕色明顯4-12平均=8三日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體正常西門氏點少見圓形，藍色深，核緊縮，滋養(yǎng)體帶狀深棕色，粗明顯6-12

平均

=8

呈菊花狀第三十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日鏡檢示教以下血片采自現(xiàn)癥病例第三十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●Redcellsarenotenlarged第三十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日Athinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresentation●Salientfeaturesare:●Developingandthick(signet)ringforms●Enlargedredcells第三十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日RecenttravelinAfrica.Pyrexiaofunknownorigin.

AtypicalPlasmodiumovalepresentationDevelopingformofplasmodiumComet-like"redcellsEnlargedredcell第三十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日Femalepatient,arrivedfromBraziltwoweekspreviously.Flulikesymptomssincearrival.AtypicalPlasmodiummalariaepresentationBroadbandformofplasmodiumRedcellsnotenlarged第四十頁，共六十三頁，2022年，8月28日Thisisathickfilmpreparedfroma32yearoldmalerecentlyreturnedfromVietnam.NumerousringformofPlasmodiumcanbeseen(asindicatedbythearrows).Notesizeofneutrophils(forcomparison).TheonlydefinitivediagnosisthatcanbemadefromthisfilmisthatMalariaispresent.Thinfilmswouldhavetobeexaminedforspeciesidentification.第四十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日讀片練習第四十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.第四十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.第四十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C第四十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日5.MalerecentlyreturnedtoAustraliaafterbackpackingthroughAsia.Historyofflulikesymptoms.第四十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日6."NewAustralian"previouslyfromMalaysia.Intermittenttemperaturesandheadaches.第四十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日7.Achesandpains,withfever.?GlandularFever,?malaria.第四十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日12.