性病實(shí)驗(yàn)室檢測的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)程[1]江干區(qū)人民醫(yī)院性病實(shí)驗(yàn)室檢測操作規(guī)程參照標(biāo)準(zhǔn)1、醫(yī)療機(jī)構(gòu)性病門診規(guī)范化管理資料匯編，2、試劑相關(guān)說明書2010.12.1目 錄一、淋病檢查的實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 3(一)分泌物涂片檢查 3（二）淋球菌的分離培養(yǎng) 6（三）淋球菌的保存 9（四）氧化酶試驗(yàn) 9二、支原體的檢測 10三、衣原體檢查 13四、梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測 17(一)直接鏡檢 17（二）非特異性梅毒螺旋體試驗(yàn) 18五、TPHA梅毒螺旋體血凝試驗(yàn) 21一、淋病檢查的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(一)分泌物涂片檢查些膿細(xì)胞內(nèi)可見革蘭氏染色呈陰性的雙球菌，橢圓或球形，常成雙排列。因形態(tài)特殊，可取患者尿道分泌物制成涂片后染色，檢查有無典型細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，可作為初步診斷的依據(jù)。標(biāo)本采集涂片鏡檢油鏡觀察。結(jié)果在急性患者的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，?？梢姷酱罅考t色多形核白細(xì)胞，有些細(xì)胞中吞噬有淋球菌。多數(shù)多形核白細(xì)胞中并不含淋菌，但不少細(xì)胞120~30于細(xì)胞漿內(nèi)。比較少，有時(shí)呈單個(gè)、四聯(lián)和八疊狀，且常位于細(xì)胞外。注意事項(xiàng)2~3不推薦用涂片檢查來診斷淋菌的直腸和咽部的方法評價(jià)感性和特異性。但其特異性隨取材部位的不同而有所不同。男性尿道取材特異性較高，而從女性子宮頸取材特異性較低。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦用涂片法來診斷女性患者。革蘭氏染色（一）操作步驟細(xì)菌涂片須經(jīng)火焰固定。3-5秒，用自來水從玻片的一端沖去染液，甩干。3-5沖洗，甩干。在標(biāo)本上，不出現(xiàn)藍(lán)色或淡紫色為宜。5.用堿性復(fù)紅復(fù)染，覆蓋標(biāo)本，3-5秒后，自來水沖洗，待其自然干燥或用吸水紙吸干，油鏡觀察。（二）淋球菌的分離培養(yǎng)如果標(biāo)本中有淋球菌，則在合適的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后可長成菌落。各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)色素和邊緣的情況等，作為細(xì)菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。方法（1）取材2.5cm以上，如果棉拭碰到糞便，應(yīng)換一個(gè)棉拭重取。檢查淋菌性咽炎時(shí)，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。為了提高陽性率，可同時(shí)取二份標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基有動物蛋白及細(xì)菌和生長所需的多種因子。目前國內(nèi)常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為抑制雜菌，在培養(yǎng)基中可加入少量抗菌素和淋球菌增菌劑，使大多數(shù)雜菌被抑制而淋球菌菌落長得較大，在平皿中幾乎呈純培養(yǎng)，從而提高分離的陽性率。培養(yǎng)條件力很弱。因此，取材后應(yīng)立即接種。接種的平皿應(yīng)先37℃溫箱中預(yù)溫。38.530℃便生長不良。最初從人體分離時(shí)，需用5%二氧化碳環(huán)境，為保持一定的濕度，可在培養(yǎng)缸中放些濕棉球。結(jié)果24~48形、凸起、浸潤、光滑、半透明或灰白色菌落。邊緣呈花瓣?duì)?，用接種環(huán)觸之有粘性。如繼續(xù)培養(yǎng)，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現(xiàn)皺縮。從菌落上四聯(lián)形或八疊形。注意事項(xiàng)10~30少量粘膜，陽性率才高。（2）對癥狀不典型的男性患者，最好是在晨起排2~3取材。對女性淋病的檢查主張用淋球菌培養(yǎng)。3624小時(shí)，菌落小，難以辨認(rèn)其特征。超過36小時(shí)，菌落方法評價(jià)組織推薦篩查淋病患者的唯一方法，也是診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn)。（三）淋球菌的保存液瓊脂上的培養(yǎng)物洗于無菌的脫脂牛奶中，存放于-252個(gè)月，于-701存于液氮中，可無限期保存。（70ml，12115分鐘）0.5ml中，低溫36℃培養(yǎng)過夜后37℃保存。使用時(shí)只需從斜面上刮下少許淋球菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不必將石蠟倒376個(gè)月以上。（四）氧化酶試驗(yàn)色反應(yīng)。1（鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺10ml小瓶，冰箱保存?zhèn)溆谩?淋球菌特征的菌落，可在其上滴加氧化酶試劑一滴，10~15秒鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色并保30（最后變成黑色3察有無紅色出現(xiàn)。菌落顯紅色為陽性。4菌氧化酶試驗(yàn)陽性，但氧化酶陽性的不全是淋球菌。為了保證有良好的反應(yīng)，不要使用過分陳舊的氧化酶試劑，正常的氧化酶試劑應(yīng)為粉紅色，如試劑已成灰黑色，說明已失效而不應(yīng)再使用。試劑配好后應(yīng)避光保存并盡快用完，因此，每次不要多配。氧化酶試劉遇鐵也會出現(xiàn)紅色而造成假陽性，因此，操作用的接種環(huán)最好用鉑絲做成，在用其它材料時(shí)應(yīng)檢查未挑菌落的接種環(huán)在接觸沾有試劑的濾紙時(shí)是否有紅色出現(xiàn)。二、支原體的檢測支原體是介于病毒和細(xì)菌之間的一類無細(xì)胞壁,能用非活體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的最小微生物。人類支原體14感染的肺炎支原體，常引起泌尿生殖道感染的解脲支原體(UU)和人型支原體(Mh)。[實(shí)驗(yàn)室檢查]一、標(biāo)本采集燥很敏感，故宜及早接種。二、分離培養(yǎng)及鑒定解脲支原體含有脲酶，以尿素為能量來源，分解尿NH4+酸釋放氨，在含有酚紅指示劑的液體培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基顏色由黃變紅。三、設(shè)備及材料1、液體培養(yǎng)基內(nèi)含牛心浸液，小牛血清，新鮮酵母浸膏，0.05%尿素，0.002%酚紅和抗生素2、普通恒溫培養(yǎng)箱四、操作50ulEPS觀察結(jié)果。五、結(jié)果判斷陽性：透明玫瑰紅（或稍有混濁）也多為陰性。六、方法學(xué)比較支原體直接鏡檢的意義不大，其形態(tài)難與組織細(xì)胞或滲出液中的其它顆粒相區(qū)別，故不利于臨床診斷。用特異性抗體鑒定支原體及血清學(xué)分型的方法有生長抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、熒光免疫反應(yīng)，但是目前還沒有理想的診斷支原體感染的血清學(xué)方法，確證必UUDienes染色后用光學(xué)顯微鏡觀察才能看清楚。三、衣原體檢查衣原體：是介于細(xì)菌與病毒之間的，專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。其主要特征是具有獨(dú)特的發(fā)育周期，在宿主細(xì)胞內(nèi)能形成光學(xué)顯微鏡可見的15D~K型。實(shí)驗(yàn)室檢查標(biāo)本采集：標(biāo)本選送的正確與否，直接影響到陽性分離率。因衣原體感染女性子宮頸柱狀上皮細(xì)胞和男性尿道上皮細(xì)胞，為確保采集到足夠的標(biāo)本量，應(yīng)將棉拭沿表面10-30本采集之前一小時(shí)內(nèi)不應(yīng)小便。采集時(shí)必須從上皮部位用力拭刮，膿性分泌物不適用于衣原體檢查，應(yīng)先清除后再采樣。抗原檢測：斑點(diǎn)免疫層析法原理：標(biāo)本窗的吸收墊含有免疫金復(fù)合物（衣原體屬特異性脂多糖表位和乳膠標(biāo)記的單克隆抗體-IgG），測試區(qū)包被有特異的抗衣原體抗體，提取液使標(biāo)本窗的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，若待測物含有衣原體抗原則與之結(jié)合，并向膜條滲移，在測試區(qū)被固相抗體所獲，顯出反應(yīng)線，過剩的復(fù)合物繼續(xù)前行，IgG陰性標(biāo)本，僅顯示質(zhì)控線。試劑準(zhǔn)備6。A溫放置，在處理過程中不斷旋轉(zhuǎn)并在管壁擠壓拭2分鐘。然后加入6滴溶液然后按感染物品的處理方法將拭子丟棄。60盒的檢測結(jié)果。B等。操作程序請?jiān)诓僮髑白屑?xì)閱讀檢測試劑盒說明書。2－3試劑盒的加樣孔中。10線顯示的時(shí)間根據(jù)拭子所采集衣原體含量的不同60為了確保陰性結(jié)果，請勿在15分鐘后判讀結(jié)果。結(jié)果：無紅線出現(xiàn)。區(qū)（T）。屬正?，F(xiàn)象。臨床意義：原體感染，但需結(jié)合臨床癥狀全面考慮。注意事項(xiàng)：87%98.8%有一定量的抗原，提取的抗原量低于試驗(yàn)敏感性時(shí)可出現(xiàn)假陰性。故試驗(yàn)結(jié)果陰性時(shí)，不能完全排除有沙眼衣原體的感染，這與標(biāo)體采集的數(shù)量不足有關(guān)。技術(shù)水平要求高。易把某些發(fā)光顆粒（白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、色素顆粒）誤認(rèn)為沙眼衣原體。四、梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(Treponemapalidum)感染引.6-20um,寬0.09-0.18um前的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有：皮膚黏膜損傷時(shí)用顯微鏡暗視野鏡檢，非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)和特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)。結(jié)合臨床可對梅毒作出肯定、推斷和提示三種判定。臨床懷疑為梅毒的病人，一般先進(jìn)行梅毒常規(guī)篩選實(shí)驗(yàn)。(一)直接鏡檢1、標(biāo)本采取刺物或活檢組織。三期梅毒取活檢組織做檢察。在硬下疳皮膚粘膜取材，需先用浸或生理鹽水的棉花球輕輕檫去覆蓋的枷皮，然后用玻片沾取滲出液。在淋巴再吸取少量淋巴液。取材后應(yīng)立即送檢。2、器材暗視野顯微鏡3、操作小而纖細(xì)，呈緊密規(guī)則的螺旋及特征性的螺旋狀運(yùn)動即可確診。（二）非特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)非特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)包括性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（venerealdiseaseresearchlaboratory不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（unheated serum reagintest,USR）和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（rapidplasmareagintest,RPR）。其原理是梅毒螺旋體可使被破壞的組織細(xì)胞釋放類脂樣物質(zhì)，螺旋體自身釋放亦產(chǎn)生類脂及脂蛋白。這些物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體（IgGIgM）。這些抗體可與從牛心中提出的心磷RPR試驗(yàn)原理：種碳粒抗原與患者血清混合在一起后，可以與血清中抗心磷脂抗體起反應(yīng)在白色紙卡上形成肉眼可見的黑色凝集顆粒。試劑：RPR試劑盒（試劑公司提供）方法：將待檢血清及試劑用前放室溫平衡50.2ml生理鹽水溶解。吸取待檢血清

在卡片圈內(nèi)，并將血清用牙簽或吸液嘴擴(kuò)展到整個(gè)圓圈。RPR針頭吸取抗原于每個(gè)血清圈內(nèi)垂直加一滴。85）如有需要，陽性標(biāo)本可做1:2 1:4 1:8 1:161:32結(jié)果判定：陽性反應(yīng)：中等或大塊黑色凝集塊。弱陽性反應(yīng)：散在的小黑色凝集塊。陰性反應(yīng)：黑色均勻分散無凝集塊。必要時(shí)應(yīng)再做TPHA試驗(yàn)確證。注意事項(xiàng)：1、本試劑應(yīng)保存于2-8℃，效期一年。2比稀釋，然后按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)，以呈現(xiàn)出明顯凝集反應(yīng)的最高稀釋度作為該血清的凝集效價(jià)。3TPHA二期梅毒時(shí)，如出現(xiàn)弱反應(yīng)和可疑反應(yīng)，應(yīng)將血清稀釋，以排除“前帶現(xiàn)象”。五、TPHA梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)試驗(yàn)原理：化的雞紅細(xì)胞，對照血球?yàn)闆]有用上述抗原包被的經(jīng)過醛化和鞣化的雞紅細(xì)胞，如果是陽性標(biāo)本，當(dāng)和致敏的雞紅細(xì)胞混合后，抗體和抗原的結(jié)合會引起致敏血球的凝集，在血凝板底部形成凝集塊，如為陰性標(biāo)操作方法：25ul（1滴）稀釋液滴）稀釋液滴稀釋液。25ul，加在第一排的孔中。25ul移液器將加樣后的第一排孔中的液體混勻后取出25ul加入第二排25ul25ul25ul25ul丟棄。25ul（1滴）75ul（1滴）45~60結(jié)果判斷：者為陰性反應(yīng)。光滑的紐扣狀；±/可凝：細(xì)胞沉積在板孔