授課人：韓伊林組織學(xué)技術(shù)（特殊染色）

1編輯ppt特殊染色用于顯示標(biāo)本中的一些結(jié)構(gòu)，使其在顯微鏡下與其它組織或細(xì)胞區(qū)別.

特殊染色單一特殊染色復(fù)合特殊染色一種染料對(duì)一種組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞進(jìn)行染色多種染料對(duì)多種組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞進(jìn)行染色2編輯ppt糖原染色方法：

糖原為細(xì)胞內(nèi)的多糖或粘多糖，肝細(xì)胞和肌細(xì)胞內(nèi)的糖原最多。糖原的多少，可以反映機(jī)體糖代謝的情況。例如：先天性糖代謝紊亂-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、間皮瘤、腎上腺瘤，肝細(xì)胞內(nèi)都可聚集過多的糖原。

3編輯ppt★過碘酸-雪夫反應(yīng)（periodicacidSchiffreaction，PAS)原理：

用過碘酸氧化多糖結(jié)構(gòu)的碳鍵，

使其形成2-醛基，與無色的品紅結(jié)合生成紫紅色品紅復(fù)合物，沉淀于細(xì)胞內(nèi)糖原分布部位，從而可證明多糖或粘多糖的存在。

4編輯ppt1、試劑配制（1）1%過碘酸水溶液：過碘酸1g

雙蒸水100ml

將過碘酸溶于雙蒸水中（2）Schiff試劑：雙蒸水200ml

堿性品紅1g1mol/L鹽酸20ml偏重亞硫酸鈉2g（或亞硫酸氫鈉）活性炭300mg5編輯ppt

※

雙蒸水煮沸后離火，慢慢加入品紅，攪拌至完全溶解，冷卻至50℃時(shí)過濾，加入鹽酸，冷卻至25℃時(shí)加入偏重亞硫酸鈉搖蕩，密封置于暗處或4℃冰箱內(nèi)24h。溶液呈草黃色時(shí)，加入活性炭搖蕩1min快速過濾。避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6編輯ppt(3)亞硫酸氫納溶液10%偏重亞硫酸氫納5ml1mol/L鹽酸5ml蒸餾水90ml用前配制(4)1mol/L鹽酸36%鹽酸85.6ml蒸餾水914.4ml7編輯ppt2、染色步驟（1)切片入1%過碘酸液氧化2-5min。

充分水洗后，過蒸餾水。（2）入Schiff液10-20min（室溫暗處）（3）入亞硫酸氫納液洗3次每次2min

（去非特異性染色）流水沖洗10min，

過蒸餾水。（4)Mayer蘇木精復(fù)染2-3min。流水沖洗，

過蒸餾水，吸干。從95%乙醇開始脫水、透明、封片。8編輯ppt3、對(duì)照用1%淀粉糖化酶處理對(duì)照片20min.或用唾液（無氣泡）消化對(duì)照片30min2次。4、結(jié)果細(xì)胞內(nèi)糖原呈紫紅色；對(duì)照片為陰性9編輯ppt5、注意事項(xiàng)：（1）糖原易溶于水，要用冷Carnoy液固定（2）配制Schiff試劑堿性品紅雜質(zhì)太多，或亞硫酸氫納潮解，都不能使堿性品紅脫色；盛Schiff試劑的瓶子不宜過大，以免SO2逸出；若Schiff試劑變成粉紅色即失效。Carnoy固定液:取純乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。一般固定1-2h。固定后的組織塊可直接入95%的乙醇脫水。10編輯ppt11編輯ppt12編輯ppt疏松結(jié)締組織各種成分顯示方法：疏松結(jié)締組織中含有：膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維；巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞。

13編輯ppt一、網(wǎng)狀纖維

分布：肝、腎、脾、淋巴結(jié)等器官內(nèi)。纖維直徑0.2-2.0μm，分支多，交織成網(wǎng)。網(wǎng)狀纖維主要由Ⅲ型膠原蛋白組成，表面被覆糖蛋白，在鍍銀切片呈黑色稱為嗜銀纖維。

14編輯pptGomoris鍍銀法顯示網(wǎng)狀纖維1、取材：淋巴結(jié)2、試劑配制（1）硝酸銀溶液：硝酸銀10.2g，溶于100ml蒸餾水。（2）氫氧化鈉溶液：氫氧化鈉3.1g，溶于100ml蒸餾水。

15編輯ppt（3）銀氨溶液的配置：取5ml

硝酸銀溶液，緩慢滴加氨水至溶液變得清亮；再加入5ml氫氧化鈉溶液，此時(shí)溶液變黑色再滴加氨水至溶液清亮后，補(bǔ)加4滴氨水，加蒸餾水稀釋至100ml，保存于棕色瓶中備用。16編輯ppt（4）高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5g，

蒸餾水95ml，3%硫酸5ml（5）氯化金溶液：氯化金0.2g，

蒸餾水100ml（6）草酸溶液：草酸2ml，蒸餾水98ml（7）硫酸鐵溶液：硫酸鐵2g，

蒸餾水100ml（8）甲醛溶液：甲醛20ml，

蒸餾水80ml17編輯ppt

3、染色程序（1）新鮮組織10%甲醛固定，石蠟切片，

常規(guī)脫蠟入水；（2）入高錳酸鉀溶液中5min，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min；（4）硫酸鐵中媒染2min，水洗1min；

18編輯ppt（5）銀氨溶液中處理1-5min（25℃），

蒸餾水洗2次，各2min；（6）甲醛溶液中還原5min，

蒸餾水洗2次，各2min；（7）氯化金溶中調(diào)色1-3min，蒸餾水洗2次；（8）95%及無水乙醇脫水，

二甲苯透明，中性樹膠封片。

19編輯ppt4、結(jié)果

淋巴結(jié)內(nèi)可見黑色網(wǎng)狀纖維，粗細(xì)不等，交織成網(wǎng)。5、注意事項(xiàng)配制氨銀時(shí)氨液不可過多。20編輯ppt21編輯ppt二、彈性纖維

分布廣泛，彈性纖維較細(xì)，直徑0.2-1.0μm，交織成網(wǎng)。富有彈性，與膠原纖維交織在一起。彈性纖維核心部分由均質(zhì)的彈性蛋白組成；外周覆蓋微原纖維。在皮膚學(xué)和檢測(cè)幼年機(jī)體組織中的彈性結(jié)構(gòu)。常用的顯示彈性纖維的染色有：地衣紅染色、Gomoris醛品紅染色、Weigert染色等。22編輯ppt地衣紅染色顯示彈性纖維1、取材皮下組織2、染液配制地衣紅染液：

地衣紅0.1g，70%乙醇100ml，硝酸2ml。3、染色程序（1）石蠟切片脫蠟下行至70%乙醇。（2）地衣紅染液，室溫，12h或過夜，或37℃,15-30min.（3）70%乙醇分色，必要時(shí)可用0.5%-1%鹽酸乙醇分色，去除膠原纖維顏色。（4）常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。4、結(jié)果彈性纖維為棕紅色，背景淡棕色。23編輯ppt24編輯ppt三、膠原纖維膠原纖維，粗細(xì)不等，直徑0.5-10μm，波浪狀，有分支交織成網(wǎng)。膠原纖維由Ⅰ型膠原蛋白組成。膠原纖維對(duì)酸性染料的親和力強(qiáng)，如常用的酸性復(fù)紅及苯胺藍(lán)等，對(duì)膠原纖維有選染性，而其它組織不易著色，從而有利于其他組織的復(fù)染。顯示膠原纖維的主要方法：如vanGieson法、Mallory法、Masson法等。25編輯pptMasson′s三色染色法顯示膠原纖維1、取材：皮下組織或腸系膜鋪片2、固定：Zenker\Bouin\10%中性福爾馬林緩沖液3、染液配制（1）Weigert鐵蘇木精A液：蘇木精10g,95%乙醇100mlB液：29%三氯化鐵水溶液4ml25%鹽酸1ml

蒸餾水95ml用時(shí)甲乙兩液等份混合，只能用數(shù)天。26編輯ppt（2）Masson酸性復(fù)紅染液：酸性復(fù)紅1g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。（3）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液：磷鉬酸2.5g，磷鎢酸2.5g，蒸餾水100ml。（4）苯胺藍(lán)染液：苯胺藍(lán)2.5g，冰醋酸2ml，蒸餾水100ml。（5）1%醋酸水溶液：冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。27編輯ppt

4、染色步驟（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水。（2）Weigert鐵蘇木精染色，10-20min。（3）流水沖洗，10min，光鏡下查看。也可用1%鹽酸乙醇（70%）分色。流水沖洗，5min，蒸餾水浸洗。28編輯ppt（4）Masson酸性復(fù)紅染液，15min，蒸餾水洗。（5）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液分色，10-15min，或至膠原纖維無紅色。（6）苯胺藍(lán)染液，10-20min，蒸餾水洗。（7）1%醋酸水溶液分色，3-5min。鏡下查看分色程度。（8）95%乙醇脫水上行，二甲苯透明，樹膠封固。

29編輯ppt5、結(jié)果：膠原纖維為藍(lán)色；肌纖維為紅色，細(xì)胞核為黑色。6、注意事項(xiàng)：標(biāo)本為10%福爾馬林固定，切片染色前需用Bouin再固定，56℃固定1h，或室溫過夜。30編輯ppt31編輯ppt伊紅-醛復(fù)紅染色法

同時(shí)顯示膠原纖維和彈性纖維

Gomori氏醛-復(fù)紅染液是Gomori在試驗(yàn)期間偶然發(fā)現(xiàn)的由堿性品紅、三聚乙醛、濃鹽酸配制而成。一、試劑配制Gomori醛-復(fù)紅染液：70%乙醇100ml，堿性品紅0.5g，三聚乙醛1ml，濃鹽酸1ml?！⒁猓合葘A性品紅溶于乙醇中，然后加入三聚乙醛和濃鹽酸，靜置1-2d，待溶液變?yōu)樯钭仙螅^濾置于冰箱待用。

32編輯ppt三、制作過程1、取皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干。2、放在甲醛-乙醇固定液內(nèi)固定5min；3、水洗3min；4、置于醛-復(fù)紅染液中，室溫下染色5min；5、水洗5min；6、置伊紅染液中，染色30s；7、常規(guī)脫水、透明、封片。四、結(jié)果膠原纖維為紅色，長帶狀，波浪狀走行；

彈性纖維為紫色，細(xì)絲狀，直行，末端卷曲。二、取材皮下組織33編輯ppt34編輯ppt甲苯胺藍(lán)染色顯示肥大細(xì)胞肥大細(xì)胞內(nèi)含粗大的嗜堿性、異染性的水溶性顆粒，顆粒內(nèi)含有組胺、肝素等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖類，能夠與甲苯胺藍(lán)、美籃、中性紅、硫堇等染料結(jié)合。

35編輯ppt1、取材皮下組織2、固定Carnoy液或10%中性福爾馬林液皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干后固定，

或石蠟切片，冰凍切片更好3、染液配制甲苯胺藍(lán)溶液：甲苯胺藍(lán)0.2g60%乙醇100ml

混勻即可反復(fù)使用。36編輯ppt4、染色過程（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水；（2）入甲苯胺藍(lán)溶液染色，室溫10-30min；（3）蒸餾水洗；（4）丙酮或100%乙醇脫水兩次，各2min；（5）二甲苯透明，樹膠封固。5、結(jié)果肥大細(xì)胞顆粒呈紫色，核淺藍(lán)色。37編輯ppt38編輯ppt胰島內(nèi)分泌細(xì)胞Masson′s三色染色法胰島在胰尾部分布較多，胰島細(xì)胞由A、B、D、PP四種細(xì)胞組成，細(xì)胞間有豐富的毛細(xì)血管。用Masson′s，Mallory等特殊染色方法可區(qū)別A、B、D細(xì)胞。1、取材胰腺2、固定Zenker\Bouin\10%甲醛

39編輯ppt3、染液配制（1）麗春紅酸性品紅液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.4g，冰醋酸1ml，

蒸餾水99ml，用1%的冰醋酸溶解麗春紅和酸性品紅。（2）2%亮綠液：亮綠2g，冰醋酸2ml

蒸餾水98ml，用2%冰醋酸溶解亮綠。40編輯ppt4、染色程序（1）切片脫蠟至水；（2）入0.5%碘乙醇5-10min，

自來水洗，蒸餾水洗；（3）入0.5%硫代硫酸鈉3-5min；（4）Weigert鐵蘇木精10-20min，自來水洗；（5）1%鹽酸乙醇分化，自來水洗藍(lán)化；

41編輯ppt（6）入麗春紅酸性品紅液3-5min，蒸餾水速洗；（7）入1%磷酸鉬水溶液5min；（8）傾去磷酸鉬，直接用2%亮綠液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸沖洗切片，將亮綠全部洗掉；（10）95%乙醇，無水酒精脫水，

二甲苯透明，樹膠封固。

42編輯ppt5、結(jié)果

A細(xì)胞染成紅色，位于胰島周邊；B細(xì)胞染成紫紅色，位于胰島中央；D細(xì)胞染成綠色，位于A細(xì)胞與B細(xì)胞之間。6、注意用10%甲醛固定，

再用重鉻酸鉀液處理，

也獲得較好效果。43編輯ppt44編輯ppt甲綠-派若寧染色顯示DNA和RNA染色原理：甲綠和派若寧是堿性染料，

染色中甲綠-派若寧染色與DNA和RNA的聚合程度有關(guān)。甲綠與聚合程度高的DNA親和力較強(qiáng)；派若寧與聚合程度低的RNA有親和力。一、固定Zenker\Carnoy(4℃)

45編輯ppt二、染液配制1、2%甲綠水溶液：甲綠2g，蒸餾水100ml※甲綠提純法：將甲綠溶解后，放入分液漏斗中，加等量的純氯仿洗，充分搖蕩數(shù)分鐘，靜置，待液體分層，放掉下層紫色氯仿液。按此法反復(fù)洗，直至洗不下紫色為止，需洗5次左右。4℃保存。2、2%派若寧水溶液：派若寧2g，蒸餾水100ml此液提純，應(yīng)按甲綠方法進(jìn)行。

46編輯ppt3、醋酸緩沖液（pH值4.8）：0.2mol/L醋酸41ml，

0.2mol/L醋酸鈉59ml。4、甲綠-派若寧染液：