幾種酶制劑檢測(cè)方法介紹精選ppt飼料酶制劑

現(xiàn)市場(chǎng)上常見(jiàn)的飼料酶制劑多為復(fù)合酶，其成分木聚糖酶、α-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶中的幾種。

如何準(zhǔn)確檢測(cè)其中的一種酶制劑的活性？精選ppt酶制劑檢測(cè)原理

酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有高度的專一性。精選ppt酶制劑檢測(cè)原理

樣品檢測(cè)：酶制劑檢測(cè)應(yīng)用酶對(duì)底物專一性的特點(diǎn)，采用高純度底物，專一檢測(cè)某種酶制劑對(duì)底物的降解，然后測(cè)定產(chǎn)物含量（分光光度計(jì)）。標(biāo)準(zhǔn)曲線：通過(guò)用其高純度的產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)分光光度計(jì)的讀數(shù)查出對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物含量，然后計(jì)算酶活。精選ppt酶制劑檢測(cè)原理精選pptA.а-淀粉酶1.碘淀粉顯色法

利用淀粉遇碘變藍(lán)的反應(yīng)，檢測(cè)出未被淀粉酶分解的淀粉，運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)定碘反應(yīng)藍(lán)值的變化，然后查表讀取酶活。

特點(diǎn)：測(cè)定а-淀粉酶的碘淀粉顯色法是專一性較高、操作較簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性也較高的方法。精選pptA.а-淀粉酶2.DNS顯色法

原理：淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，將3，5–二硝基水楊酸試劑還原生成3–氨基–5–硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。

特點(diǎn)：專一性不高，易受其他淀粉酶（主要是β-淀粉酶）的干擾，因此，碘淀粉顯色法應(yīng)用較多。精選pptB.蛋白酶

1.Folin法原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，在堿性條件下，酚基氨基酸與Folin試劑反應(yīng)生產(chǎn)藍(lán)色物質(zhì)，于680nm比色測(cè)定光吸收值，計(jì)算酶活力。該法的準(zhǔn)確性及靈敏度都較高，在國(guó)內(nèi)已得到公認(rèn)，是應(yīng)用最廣的方法，我國(guó)的部頒標(biāo)準(zhǔn)及各大酶制劑生產(chǎn)企業(yè)都采用該法。精選pptB.蛋白酶2.紫外分光光度法

原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，利用酪氨酸在280nm處有特征性吸收峰,測(cè)定計(jì)算酶活。

特點(diǎn)：紫外線操作比Folin法簡(jiǎn)便，但靈敏度僅為Folin法的1/10。精選pptC.產(chǎn)還原糖酶制劑

現(xiàn)今采用的還原糖法通常是比色法，黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顯色反應(yīng)與不同聚合度同源寡糖還原性末端的含量成正比。

特點(diǎn)：易于操作，價(jià)格低廉，方便快速，重復(fù)性好

精選pptC.產(chǎn)還原糖酶制劑能產(chǎn)生還原糖的酶有：包括纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等。

半纖維素酶是分解半纖維素(包括各種降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱,主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。精選pptC.產(chǎn)還原糖酶制劑

1.還原糖法

2.粘度法

3.瓊脂平板擴(kuò)散法4.可溶性的染色底物精選ppt1.還原糖法還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。精選ppt2.粘度法原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通過(guò)粘度計(jì)測(cè)定流速改變來(lái)計(jì)算酶活力。該法靈敏度較高，可形象反映外切酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用方式，較適宜于飼用酶活性的測(cè)定。特點(diǎn)：重復(fù)性差，費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜、單位難以換算成國(guó)際單位。精選ppt3.瓊脂平板擴(kuò)散法

原理：將NSPS底物與瓊脂混融制成瓊脂平板，將酶樣點(diǎn)于瓊脂板上的小孔中，培養(yǎng)一定時(shí)間，選用能與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑染色，顯示出染色背景區(qū)和無(wú)色透明的水解區(qū)，水解區(qū)直徑與酶量的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)，由水解區(qū)直徑計(jì)算酶活力。

特點(diǎn)：靈敏度高，是還原糖法的100倍，測(cè)定所需樣品量微，無(wú)需特殊設(shè)備。精選ppt4.可溶性的染色底物原理：人工合成的含色原基團(tuán)的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光光度計(jì)比色測(cè)定有色物質(zhì)含量，計(jì)算酶活力。特點(diǎn)：重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，靈敏度較高，但合成底物與天然底物有區(qū)別，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能有影響

，并且底物昂貴。精選pptD.脂肪酶原理：脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所釋放的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH或酚酞指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活。

反應(yīng)式為：

RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O精選pptE.植酸酶1.國(guó)標(biāo)法（釩—鉬酸銨法）原理：利用植酸酶水解植酸鈉產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再加入酸性鉬釩試劑終止反應(yīng)，同時(shí)與無(wú)機(jī)磷反應(yīng)生成黃色釩鉬磷絡(luò)和物，在415nm比色測(cè)定含磷量，再以標(biāo)準(zhǔn)植酸酶為參照物，間接計(jì)算被測(cè)樣品中植酸酶的含量。精選pptE.植酸酶2.硫酸亞鐵—鉬藍(lán)法原理：利用植酸酶可以水解植酸酶釋放無(wú)機(jī)磷的原理，通過(guò)加入鹽酸使水解反應(yīng)停止，然后加入鉬酸銨及FeSO47H2O的混合液使溶液顯色，在720nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸收值，以標(biāo)準(zhǔn)酶為參照物，間接計(jì)算被測(cè)樣品中植酸酶的含量。精選pptE.植酸酶

3.丙酮—磷鉬酸銨法原理：磷酸鹽與過(guò)量的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可慢慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后使黃色物質(zhì)提出來(lái)，在355nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，靈敏度增加10倍。

特點(diǎn)：釩—鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強(qiáng)。精選pptE.植酸酶

4.VC—鉬藍(lán)法原理：該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無(wú)機(jī)磷的原理，通過(guò)加入三氯乙酸使反應(yīng)停止，然后加人鉬酸銨與VC的混合液，使溶液顯色，在820nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，再以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對(duì)應(yīng)的酶活單位建立直線回歸方程，最后以待測(cè)樣品吸光度代人方程，計(jì)算出酶活性。精選ppt影響酶活力的主要因素A.底物種類和濃度B.酶活力單位定義C.酶反應(yīng)pH值D.酶反應(yīng)溫度E.酶反應(yīng)時(shí)間精選pptA.底物種類和濃度同種方法采用不同底物測(cè)定，結(jié)果相差很大。例如木聚糖酶的檢測(cè)，燕麥木聚糖與樺木木聚糖的測(cè)定結(jié)果就有明顯差距。

精選ppt底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響圖精選pptB.酶活力單位定義

國(guó)際酶學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1umol底物的酶量，稱一個(gè)國(guó)際單位（IU）。

酶活計(jì)算公式：酶活性

(U/g)=A×D×10000.2×10×150.13×W其中: A–比色測(cè)定的木糖量，mg/ml；D–稀釋倍數(shù)；1000–當(dāng)量換算因數(shù)，mmol->umol

；W–酶樣品重量，g；150.13–木糖的分子量，mg/mmol；10–反應(yīng)時(shí)間，分鐘。精選pptB.酶活力單位定義

木聚糖酶的活性定義A：在測(cè)定條件下，1秒鐘從燕麥木聚糖中產(chǎn)生1nmol木糖所需的酶量。

酶活計(jì)算公式：酶活（IU）=A×D×1,000,000

0.2×600×150.13×W其中: A–比色測(cè)定的木糖量，mg/ml；D–稀釋倍數(shù)；1,000,000–當(dāng)量換算因數(shù)，mmol->nmol；

W–酶樣品重量，g；150.13-木糖的分子量，mg/mmol。

600–反應(yīng)時(shí)間，秒。精選pptC.酶反應(yīng)pH值pH影響酶活力的因素:

①影響酶蛋白構(gòu)象，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶變性。

②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。

③影響酶和底物分子中另一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。

影響酶與底物的結(jié)合，極度pH的條件引起酶蛋白的變性。精選pptC.酶反應(yīng)pH值最適pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的介質(zhì)pH。

最適pH一般接近在4~8之間.精選pptD.酶反應(yīng)溫度

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響有兩個(gè)方面：①提高溫度，加快反應(yīng)速度。②提高溫度，酶變性失活。這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時(shí)，前一種因素為主；在大于最適溫度時(shí)，后一種因素為主。最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。精選pptD.酶反應(yīng)溫度精選pptE.酶反應(yīng)時(shí)間酶反應(yīng)方程式：隨著生成物濃度的增加，酶反應(yīng)速度減慢，當(dāng)生成物達(dá)到某一濃度，酶反應(yīng)即停止。精選pptE.酶反應(yīng)時(shí)間

從圖中可以看到，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，由于底物濃度降低，產(chǎn)物反饋抑制，逆反應(yīng)速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應(yīng)速度逐漸下降，最后完全停止。精選pptE.酶反應(yīng)時(shí)間

在測(cè)定酶促反應(yīng)速度時(shí)，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應(yīng)初期進(jìn)行，在最初這段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度稱之為反應(yīng)初速度，在過(guò)量的底物存在下，反應(yīng)初速度與酶濃度成正比。精選pptF.激活劑、抑制劑凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。激活劑作用包括兩種情況：

一種是由于激活劑的存在，使一些本來(lái)有活性的酶活性進(jìn)一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡(jiǎn)單有機(jī)化合物。

另一種是激活酶原，無(wú)活性→有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質(zhì)。

精選pptG.舉例

2種木聚糖酶測(cè)定方法的比較測(cè)定條件

方法1方法2

溫度

55℃50℃pH

5.35.5緩沖液

0.05M醋酸鈉緩沖液0.1M醋酸鈉緩沖液反應(yīng)時(shí)間

10min30min底物濃度

1％木聚糖1.2%木聚糖