第三篇遺傳信息的傳遞第十九章細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制主要內(nèi)容

劉皓email:生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室第三篇遺傳信息的傳遞

DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯基因表達調(diào)控基因重組與基因工程（1958，F(xiàn).Crick）Reversetranscription

第十四章

DNA的生物合成

DNABiosynthesis

(DNAReplication)復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA主要內(nèi)容

復(fù)制的基本特征

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化復(fù)制的過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

DNA損傷（突變）與修復(fù)復(fù)制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)

復(fù)制的基本特征

一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征

DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律指導(dǎo)合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。由于堿基互補，兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念:N15N15-yellowstrandN14-blackstrandN14G0G1G2heavyintermediatelightMeselson-Stahlexperiment

DNAcentrifugedinCesiumChloride,heavyDNAsettleslowerintubeRP5N15-DNAN14-DNAAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA復(fù)制的分子基礎(chǔ)：堿基配對規(guī)律和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。復(fù)制時，DNA從特定的起始點(origin，ori)開始向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制叉(replicationfork)：復(fù)制時DNA雙鏈解開成雙股，各自作為模板，子鏈延模板延長時所形成的一種Ｙ字形結(jié)構(gòu)。

二、雙向復(fù)制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點B.復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(termination,ter)oriterABC真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子(replicon)

。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’三、半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(laggingstrand)

。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationDNA復(fù)制的反應(yīng)體系:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。

參與DNA復(fù)制過程的酶或蛋白質(zhì)因子：

a.DNA聚合酶(DNApolymerase)b.與DNA解旋和解鏈有關(guān)的酶：解螺旋酶(Helicase)

引物酶(Primase)

拓撲酶(DNAtopoisomerase)

單鏈DNA結(jié)合蛋白(Single-strandDNA-bindingprotein,SSB)c.DNA連接酶(DNAligase)一、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶

(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol1.復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPiDNA聚合酶的作用特點以四種脫氧三磷酸核苷(dNTP)作底物；需要接受模板的指導(dǎo);DNA新鏈生成需引物3’-OH的存在；新鏈的延長只可沿5→3方向進行。（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅠ（109kD）323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?切除引物和突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性:

DNA-polⅠ

功能：對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。核心酶：α，θ和ε亞基原核生物的DNA聚合酶共性：都具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性（二）真核細胞DNA聚合酶：五種DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol真核生物的DNA聚合酶(三)DNA聚合酶與復(fù)制的保真性

(fidelity)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。a.核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認切除錯配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。

A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNApolⅠ的校讀功能b.復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇錯配堿基之間難以形成氫鍵DNA聚合酶對核苷酸的參入有選擇功能遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；復(fù)制出錯時DNA-pol的即時校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：二、與DNA解旋與解鏈有關(guān)的酶DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)E.Coli基因圖1.解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。2.引物酶(primase)

——復(fù)制起始時催化游離NTP聚合生成RNA引物的酶。3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)

——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。SSB與DNA單鏈的結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。108局部解鏈后4.DNA拓撲異構(gòu)酶:改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈復(fù)制過程正超螺旋的形成：解鏈過程中正超螺旋的形成既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ拓撲異構(gòu)酶分類：拓撲異構(gòu)酶作用特點：拓撲異構(gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制：三、DNA連接酶催化互補雙鏈DNA中單鏈切口處的相鄰3-OH末端和5-P末端之間生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。

DNA連接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶的作用：

DNA連接酶并不能連接單獨存在的單鏈DNA缺口，它所連接的都是在堿基互補的基礎(chǔ)上的缺口。

DNA連接酶也可連接DNA兩股鏈都有的缺口，但缺口的堿基必須互補。DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較

提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓撲酶切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli復(fù)制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.DNA解鏈識別區(qū)富含AT區(qū)DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB35352.引發(fā)體(primosome)和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶

復(fù)制起始的順序

DnaA辨認結(jié)合Ori識別區(qū)，幾個Dna蛋白相互靠近，并使富含AT區(qū)開鏈

DnaC協(xié)同DnaB進入起始部位

DnaA

進一步解鏈,SSB與解開的單鏈結(jié)合

引物酶（DnaG）進入

形成引發(fā)體

以NTP為原料,從5′3′合成RNA引物

DNAPOLⅢ催化第一個dNTP加到RNA引物的3/-OH上（二）復(fù)制的延長過程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polⅢ領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長。隨從鏈的合成解鏈方向同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復(fù)制的終止過程：切除引物、填補空缺、連接切口555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：復(fù)制過程簡圖二、真核生物的DNA合成端粒(telomere)

指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點：由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成：端粒酶兼有提供RNA模板和催化逆轉(zhuǎn)錄的功能。逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶的活性：依賴RNA的DNA聚合酶RNase依賴DNA的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNARNA病毒在細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖。前病毒基因組通過基因重組，整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達。前病毒獨立繁殖或整合，都可成為致病的原因。分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)二、滾環(huán)復(fù)制是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。3-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'5335DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)&Repair第五節(jié)DNA突變：指個別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。突變的分子基礎(chǔ)：DNA分子上堿基的改變二、引發(fā)突變的因素自發(fā)突變：發(fā)生頻率約10-9左右誘發(fā)突變：主要有物理和化學(xué)因素物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV化學(xué)因素：三、ＤＮＡ突變的類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。自發(fā)突變和不少化學(xué)誘變都能引起DNA上某一堿基的置換。點突變發(fā)生在基因的編碼區(qū)，可導(dǎo)致氨基酸改變。

（一）錯配可導(dǎo)致編碼氨基酸的改變鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因鐮形紅細胞貧血病人（二）缺失、插入和框移突變造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變?nèi)笔В阂粋€堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個