2新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1102020**月日實施02新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1目的規(guī)范PCR2范圍3職責(zé)檢驗人員負(fù)責(zé)按照本檢測細(xì)則對被檢樣本進(jìn)行檢測；復(fù)核人員負(fù)責(zé)對檢測操作是否規(guī)范以及檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)核；4程序、內(nèi)容和要求任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備適當(dāng)條件的實驗室由經(jīng)過相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。本程序中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框openreadingframe1RF1ab）和核殼蛋白nucleocapsidproe。在實驗室要確認(rèn)一個病例為陽性，滿足以下條件：同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個靶標(biāo)（ORF1abN）特異性PCR檢測結(jié)果均為陽性。PCR抑制等。樣本采集（咽拭子）咽拭子（使用透景樣本保存液）用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入樣本保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋作為樣本使用。鼻拭子（使用透景樣本保存液）將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔鼻咽拭子樣本（未使用透景的保存液：在有鼻咽拭子的收集管中加入1ml生理鹽水，振蕩混勻后將全部液體倒入1.5ml滅菌離心管中作為樣本使用。標(biāo)本保存用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測244℃24-70（-70冰箱暫存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为?dú)保存標(biāo)本，標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本滅活為了減少感染樣本對人和環(huán)境的潛在危害，推薦樣本檢測前進(jìn)行滅活處理：先水浴60mi，靜置10min至室溫（避免氣溶膠，然后進(jìn)行處理。核酸提取24.4.1.196孔提取板內(nèi)。運(yùn)行實驗程序前，檢查96孔提取板及磁棒套是否正確放置（磁棒套順著卡槽推入到盡頭。4.4.1.2確保儀器的電源線與合規(guī)格的電源插座連接好后，打開儀器背面右下的主電源開關(guān)。儀器上電開機(jī)后，進(jìn)行自檢。如下圖所示：待完成自檢后系統(tǒng)進(jìn)入主菜單操作界面。如下圖所示：主界面主要包括儀器功能選項及快捷實驗運(yùn)行方式的圖標(biāo)及“程序列表e)點擊和按鍵查看完整程序運(yùn)行步驟；e)點擊和按鍵查看完整程序運(yùn)行步驟；f)點擊按鍵后，實驗程序?qū)㈤_始運(yùn)行。注意：96孔提取板是否正確放置；注意：磁棒套是否推入到位；注意：儀器門是否關(guān)好。能打開。實驗結(jié)束后，儀器彈窗實驗結(jié)束。k)點擊進(jìn)行紫外燈照射消毒。k)點擊進(jìn)行紫外燈照射消毒。4.4.1.32指導(dǎo)原則：當(dāng)Smart32器不需要定期的維護(hù)，但是，應(yīng)由經(jīng)過廠商指導(dǎo)的實驗室技術(shù)人員進(jìn)行定期的清潔與自測診斷。的灰塵粒子。用微濕的軟布進(jìn)行Smart3210%的家用漂白劑及去離子洗或執(zhí)行任何本節(jié)所提到的維護(hù)前，務(wù)必關(guān)閉Smart32核酸提取或純化試劑標(biāo)準(zhǔn)操作程序原理、磁珠洗滌液2的作用下，將蛋白質(zhì)，無機(jī)鹽離子和許多有機(jī)雜質(zhì)去除。然后洗脫液將純凈的核酸洗脫下來。標(biāo)本要求標(biāo)本類型：血清、血漿、宮頸脫落細(xì)胞、咽拭子、鼻咽分泌物等。標(biāo)本采集：血清2室溫（22～25C）放置30～60分鐘，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，1500rpm離心51.5ml血漿—用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5～10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，1.5ml方案。宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的采集需醫(yī)護(hù)人員先用窺陰器或陰道張開器暴露宮頸4-62ML生理鹽水的無菌小試管中。12-201512試劑及儀器設(shè)備試劑名稱：核酸提取或純化試劑。盒962K1貯存條件和有效期：室溫保存；有效期12Smart32操作試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作，從試劑盒中取出預(yù)分裝96孔深孔板，顛倒混勻數(shù)次96500rpm1小心撕去封膜，防止液體濺出。標(biāo)本制備及加樣（在標(biāo)本制備區(qū)操作。HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HCV臨界陽性質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。在96、7（A-H排）200ul20ul蛋白酶K。使用型核酸提取儀進(jìn)行核酸提?。ú僮饕姴僮鞒绦颍┏绦蛟O(shè)置型核酸提取儀程序編輯）步 孔 等待時混合時吸磁次混合速容積驟位名稱間min間min數(shù)度ul溫度狀態(tài)12磁珠013中400關(guān)021磁珠結(jié)合液0153快750第一孔7033磁珠洗滌液1022快600第6孔5044磁珠洗滌液2001中600第6孔7056洗脫液053中100第6孔7063丟棄磁珠010中600關(guān)0612-204.4.2.5注意事項實驗前請仔細(xì)閱讀本試劑說明書。不同型號的核酸提取儀由于硬件的關(guān)系可能需設(shè)置不同的提取程序試劑廠家。標(biāo)本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄。10%75%物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則和醫(yī)療廢物管理條例樣本釋放劑標(biāo)準(zhǔn)操作程序預(yù)期用途樣本的采集保存、病毒滅活裂解、核酸的釋放。采集拭子樣本，放入含有樣本核酸釋放保DNA或RNA即可釋放，直接作為PCR原理的核酸保護(hù)劑成分，對DNA或RNA適用范圍：拭子類樣本（鼻眼結(jié)膜）使用方法放47-20-8030分鐘。1分鐘，靜置5作3次，然后瞬時離心，核酸即釋放到保存液中，直接吸取上清液作為模板，加入到PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。釋放出的核酸可在室溫放置48，41個月，-20存放6個月。性能指標(biāo)樣本存放在47-80處理后的核酸模板可直接進(jìn)行PCR檢測，對PCR注意事項本產(chǎn)品僅用于體外檢測，實驗前請仔細(xì)閱讀本說明書。的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；樣本操作和實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR實驗過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)，所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；使用無DNA/RNA 酶的PCR反應(yīng)管和吸頭4.4.4新型冠狀病毒（2019-nCoV）基因擴(kuò)增檢測RT-PCR2019（2019-nCoVORF1ab和N（N基因探針采用FAM標(biāo)記，ORF1ab探針采用Yellow）用于標(biāo)本中2019新型冠狀病毒RNA的檢測。儀器設(shè)備：ABI75004.4.4.3操作2新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1102020**月日實施試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作），從試劑盒中取出NC(ORF1ab/N)PCR反應(yīng)液ANC(ORF1ab/N)PCR反應(yīng)液B離心數(shù)秒后使用。取N個（N＝+NC(ORF1ab/N)陰性質(zhì)控品+NC(ORF1ab/N)陽性質(zhì)控品反應(yīng)管，單人份擴(kuò)增體系配制如下表：標(biāo)本制備及加樣（在標(biāo)本制備區(qū)操作標(biāo)本處理：使用樣本釋放劑采樣管直接采樣送檢：將采樣后的拭子高出采樣管的部分折斷，拭子頭浸沒在含有400uL管中，擰緊管蓋送檢；將采樣管置于303015使用核酸提取儀：取200ul液體樣本加入磁珠提取試劑樣本孔位，使用取（操作見核酸提取儀及核酸或純化試劑標(biāo)準(zhǔn)操作程序）PCR1擴(kuò)增（在擴(kuò)增區(qū)操作）將加好樣的反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：個循環(huán)；鐘，1個循環(huán)；94℃15秒55℃45個循環(huán)。結(jié)果判定（ABI7500）反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)的值、End值以及（3～15End值可設(shè)在5～20，Log圖譜窗口設(shè)置Value擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線，點擊Analysi“Repor記錄檢測結(jié)果，簽發(fā)檢測結(jié)果報告。結(jié)果判斷如果檢測樣品在FAM和VIC通道無擴(kuò)增曲線或CtCy5通道有擴(kuò)增曲2019(2019-nCoV)RNA2新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1102020**月日實施如果檢測樣品在FAM和VIC通道Ct值≤4，且有明顯的擴(kuò)增曲線，可判樣品為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)陽性；如果檢測樣品僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤42019新型冠狀病毒斷為未檢測到2019(2019-nCoV)RNA質(zhì)量控制NC(ORF1ab/N)陰性質(zhì)控品：FAM和VIC檢測通道無明顯擴(kuò)增曲線，通道有明顯擴(kuò)增曲線；NC(ORF1ab/N)FAM和VICCt值≤3，Cy5需重新進(jìn)行。性能指標(biāo)及線性范圍試劑分析靈敏度為500copies/l與2019新型冠狀病毒種屬相近或引起癥狀相似的其（如季節(jié)性甲型H1N1流感病毒H1N1(2009)H3N2，H5N1H7N9，乙型流感Yamagat，乙型流感Victora呼吸道合抱病毒A型，呼吸道合抱B型，副流感I、、345、755腸道病毒ABCD型，人間質(zhì)肺病毒（人偏肺病毒EB病毒，麻疹病毒，人巨細(xì)胞炎克雷伯桿菌，結(jié)核分枝桿菌，煙曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隱球菌，冠狀病HKU1OC43NL63229ESARSMERS冠狀病毒以及人基因組DNA無交叉反應(yīng)。注意事項本產(chǎn)品僅用于體外檢測，實驗前請仔細(xì)閱讀說明書；處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求和《醫(yī)療廢物管理條例產(chǎn)物處理：PCR全程應(yīng)避免RNA紫外光殺菌的化學(xué)通風(fēng)櫥或生物安全柜完成操作，避免有害物質(zhì)進(jìn)入呼吸道；5.DNA酶、RNA酶的離心管和吸頭；PCR檢測試劑使用前要完全解凍，如果在樣本處理中沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性；實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范（本制備區(qū)、擴(kuò)增檢測區(qū)，所用消耗品應(yīng)滅菌實驗完畢用10%次氯酸或75%分鐘；-20(24h須對每次實驗進(jìn)行質(zhì)量控制。樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴(yán)格