儀器分析在花色苷中的應(yīng)用第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日1花色研究概況色素的化學(xué)分析：類胡蘿卜素、花色素苷、葉綠素、甜菜色素

花色變異機(jī)理色素生物合成途徑（基因、關(guān)鍵酶）分子育種改良花色第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日影響花色形成的主要因素色素組成助色素：黃酮醇、二氫黃酮等金屬離子：Al3+、Fe3+、Mg2+等pH值細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日2花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)2.1花色苷化學(xué)結(jié)構(gòu)

花色苷（anthocyanin）為黃酮類化合物，是由花色素和各種糖形成的配糖體?；ㄉ兀╝nthocyanidin）是具有類黃酮典型結(jié)構(gòu)的2-苯基苯并吡喃陽離子的衍生物，以C6－C3－C6

為基本骨架，目前已知有20種花色素。形成配糖體的主要的糖有：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、蕓香二糖、龍膽二糖、槐二糖等?；ㄉ卦?、5、7等位置與糖結(jié)合后形成糖苷，因此花色苷也相應(yīng)地被分為單糖苷、二糖苷或三糖苷.第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日2.2影響花色苷顏色穩(wěn)定性的主要因素花色苷的?；饔茫河袡C(jī)酸如ｐ-香豆酸、咖啡酸和琥珀酸等通常與花色苷的3、5、7或3′位上的糖結(jié)合,形成單酰、二?；蚨圊；ㄉ剀?。?；ㄉ諈⑴c分子內(nèi)輔助著色或分子間輔助著色反應(yīng)，是花色苷在較寬的pH值范圍內(nèi)顏色穩(wěn)定表現(xiàn)。pH值的作用：在溶液介質(zhì)中,花色苷會(huì)隨pH有幾種結(jié)構(gòu)的變換。對(duì)于一個(gè)給定的pH值,在花色苷的4種結(jié)構(gòu)之間存在著平衡:藍(lán)色的醌式(脫水)堿、紅色的花钅羊正離子、無色的甲醇假堿和查爾酮。金屬離子：?；ㄉ嘏c輔助色素、金屬發(fā)生反應(yīng),形成復(fù)合花色素苷。第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日研究的主要對(duì)象：羥基的位置和數(shù)量、糖的類型及位置、?；饔?、取代基等研究的主要方法：光譜法－－紫外可見光譜、紅外吸收光譜，色譜法，核磁共振波譜法，質(zhì)譜法3花色素苷的定性分析第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日3.1光譜法3.1.1紫外可見光譜法紫外-可見光譜很早就被人們應(yīng)用于花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定。該法主要有如下幾點(diǎn)：①花色苷最大吸收波長一個(gè)在可見光區(qū)的500～540nm附近，另一個(gè)在紫外275nm附近，通過測定色素的最大吸收波長即可判斷是否為花色苷類色素。②如果向花色苷的0.01%鹽酸甲醇溶液中滴加3～5滴ＡlＣl3甲醇或乙醇溶液,出現(xiàn)藍(lán)移，即最大吸收波長增加，說明Ｂ-環(huán)有鄰位酚羥基，即可區(qū)分Ｂ-環(huán)無鄰位酚羥基的天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素和Ｂ-環(huán)有鄰位酚羥基的矢車菊色素、牽牛花色素、飛燕草色素。第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日③根據(jù)花色苷最大吸收波長處的吸光度和440nm處的吸光度的比值Ａ440/Ａmax，參考文獻(xiàn)后，可以判斷糖苷的位置。④根據(jù)花色苷在300～330nm間有無吸收峰可判斷該色素分子是否有?；?，如果有吸收峰，表明該色素有?；嬖?。⑤根據(jù)花色苷在440nm處是否有肩峰，可以判斷該色素5號(hào)位的羥基是否被取代。如果5號(hào)位的羥基沒有被取代，則該色素在440nm處有肩峰。⑥根據(jù)花色苷在紫外光下是否有熒光，可判斷該色素是否在5號(hào)位有取代基，如果有熒光則表明該色素在5號(hào)位有取代基。第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日

3.1.2紅外吸收光譜

目前,紅外吸收光譜應(yīng)用于花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定不太廣泛。花色苷的紅外光譜主要有苯環(huán)、含氧雜環(huán)、糖和羥基和甲氧基四部分。其中雜環(huán)的C＝O鍵的吸收峰在1630-1620cm-1，苯環(huán)和雜環(huán)的C一C鍵有三個(gè)吸收峰：Ⅰ：1605-1580cm-1，Ⅱ

：1577-1565cm-1，Ⅲ：1518-1485cm-1

。苯環(huán)C-H鍵的吸收峰在900-800cm-1，4-H:905－885cm-1，6-H:839-848cm-1，8-H:809一830cm-1。B環(huán)C-H鍵的吸收峰位置受取代基影響，不同的苷原也不相同。甲氧基和經(jīng)基的吸收峰在1120-1010cm-1?；ㄉ盏囊姨a(chǎn)物的C=O鍵引起的峰在1654－1695cm-1。第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日3.2色譜法

利用色譜法進(jìn)行花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定需要對(duì)花色苷進(jìn)行酸水解、堿降解和過氧化物降解等處理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有機(jī)酸游離出來，再通過標(biāo)準(zhǔn)的糖苷配基、糖和有機(jī)酸作對(duì)照或參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù),進(jìn)行色譜分析。各樣品的分析方法主要有：微晶纖維素薄層層析法(CellucoseTLC)，紙層析，HPLC，分析糖類時(shí)還有采用衍生化氣相色譜法的報(bào)道，RP-HPLC應(yīng)用于花色苷結(jié)構(gòu)鑒定也逐漸多了起來。第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日3.3核磁共振波譜法

核磁共振技術(shù)是有機(jī)結(jié)構(gòu)鑒定的重要手段之一。在分子生物學(xué)，藥物化學(xué)，植物化學(xué)等諸多方面有廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用于花色苷的分析從二十世紀(jì)七十年代末已經(jīng)開始了。常用的有，1H一NMR和13C一NMR譜法?；ㄉ赵诓煌琾H值條件下，會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，在酸性環(huán)境中呈钅羊鹽離子態(tài)時(shí)較容易測定，所以常用以下溶劑：CD3-TFA-d(氘代甲醇-三氟醋酸)，DMsO-d6-TFA(六氘代二甲亞砜-三氟醋酸)，D2O-DCI(重水-氘代氯化氫)，CD3OD-DCl。各質(zhì)子的信號(hào)范圍：苷原9-6ppm，糖中半縮醛的質(zhì)子6-4.5ppm，H>C=H<H7-6ppm，大多數(shù)糖的質(zhì)子在4-3ppm。第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日3.4質(zhì)譜法

質(zhì)譜是二十世紀(jì)初發(fā)展起來的物理分析方法。在一定條件下能對(duì)復(fù)雜的有機(jī)物給出確定的，可以重復(fù)的質(zhì)譜圖，由分子的斷裂規(guī)律得到許多的結(jié)構(gòu)信息。FAB(FastAtomBombardment)是八十年代發(fā)展出的新離子源，多采用惰性氣體，如氫，氘等中性原子流轟擊樣品使之離子化。FAB一MS具有較高的靈敏度，適用于分析極性大分子量較大的化合物。在花色苷的研究中主要用于花色苷的分子量的確定。第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日4花色素苷的定量分析4.1含有很少或者不含有干擾物質(zhì)的體系中花色苷總量的測定：花色苷的最大吸收區(qū)在500～550nm范圍內(nèi)，而離這一范圍最近的類黃酮的最大吸收范圍在350～380nm。在新鮮的植物提取物中，因?yàn)楹苌俸性诨ㄉ盏淖畲笪諈^(qū)發(fā)生吸收的干擾物質(zhì)，花色苷總量可以利用比耳定量通過適當(dāng)波長處的吸光度來測定。該方法測定花色苷總量需要在一個(gè)恒定的pH介質(zhì)中進(jìn)行。除了需要在定性的基礎(chǔ)上確定花色苷的種類，還需要測定單個(gè)花色苷的最大吸收波長下的摩爾消光系數(shù)ε或比消光度Ｅ。又因?yàn)閱蝹€(gè)花色苷的差別很小，而且單個(gè)花色苷組成的比率未知，所以一般用平均比消光度avE來測定花色苷總量，誤差小于0.2%。但是，單個(gè)花色苷的比消光度E是很難得到的，所以我們可以參考文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)。第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日4.2含有干擾物質(zhì)的體系中花色苷總量的測定：

4.2.1pH示差法：該法依據(jù)之一是花色苷發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，依據(jù)之二是超干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH而變化。通過實(shí)驗(yàn)，確定兩個(gè)對(duì)花色苷吸光度差別最大但是對(duì)花色苷穩(wěn)定的pH值，根據(jù)Fuleki的公式可以計(jì)算出花色苷總量。

4.2.2差減法：差減法就是先測定樣品在可見光區(qū)最大吸光度，經(jīng)二氧化硫或亞硫酸鹽漂白或過氧化氫氧化后，再測定一次吸光度,二者的差值就是花色苷的吸光度。參考用標(biāo)準(zhǔn)花色苷繪制的工作曲線，將吸光度換算成濃度。但是，差減法因所使用的漂白劑也能降低某些干擾組分的吸光度而使總花色苷濃度偏高。4.3單個(gè)花色苷的定量：

HPLC是廣泛使用的方法。第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日5其它應(yīng)用細(xì)胞pH值的測定花瓣顏色的判定第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日5.1花瓣細(xì)胞pH值測定

主要方法：熒光探針法、電化學(xué)法、核磁共振波譜法第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日原理：熒光探針強(qiáng)度隨pHi升高呈線形變化主要的熒光探針：SNAFL、BCECF、NERF等方法：熒光比值法優(yōu)點(diǎn)：操作方便、對(duì)于細(xì)胞損傷小應(yīng)用：Asen等人于1975年應(yīng)用這一方法對(duì)二百余種植物的花進(jìn)行了細(xì)胞pH值的測定第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日5.2顏色的分析乳白玻璃投射法（Satio，1967）積分球法(Yasuda，1967)顯微分光光度計(jì)法（Asen，1971）第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日顏色測定實(shí)例八仙花花瓣的反射光譜的測量

新鮮的花瓣切成10×10mm2，固于一個(gè)蓋玻片上，然后放在一個(gè)BaO白板上。將此板放在JASCOUbest－55分光光度計(jì)的一個(gè)積分球裝置上，記錄400～800nm的反射光譜。八仙花細(xì)胞原生質(zhì)體可見光譜的測量將200μl原生質(zhì)體懸浮液倒在聚賴氨酸預(yù)包裹的蓋玻片上（18×18mm2），在室溫下放置1min，去除懸浮緩沖液后，將蓋玻片放于一個(gè)塑料盤中（35mmΦ）并加入2ml儲(chǔ)存緩沖液（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，KCl的濃度在0.1mM和10mM之間變化）。然后將其放在裝有顯微分光光度計(jì)（MCPD7000；Photal）的顯微鏡（IX70；Olympus）下觀察，在直徑10μm的光學(xué)光束條件下，測量有色原生質(zhì)體在可見光區(qū)（400～800nm）的吸收光譜。

(K.Youshida,2003)第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日6花色苷國內(nèi)外研究實(shí)例植物材料色素實(shí)驗(yàn)方法研究者發(fā)表時(shí)間秋海棠花青素NMR（分析?；?、HPLC（分離）NodiveChirol，1992鴨趾草復(fù)合花色素鴨跖草苷UV-Vis、NMR、HPLCT.Kondo，1992藍(lán)靛果花色苷紅外吸收光譜李景琳、吳信子，1993土丁桂3-葡萄糖基咖啡酰葡萄糖基咖啡