植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲(chóng)的相關(guān)問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì),植物保護(hù)論文植物寄生線蟲(chóng)是重要的植物病原物之一，分布廣，種類多，主要包括根結(jié)線蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)、莖線蟲(chóng)及香蕉穿孔線蟲(chóng)等，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年因寄生線蟲(chóng)造成的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損踐約在1000億美元以上。長(zhǎng)期以來(lái)，廣泛使用化學(xué)藥劑對(duì)線蟲(chóng)病害進(jìn)行防治雖獲得較好的效果，但存在高毒、高殘留的弊端。近年來(lái)，隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)和高毒、高殘留農(nóng)藥的禁用，生物防治日益遭到重視，并且被以為是最具發(fā)展前景的防治手段。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了大量的研究工作，對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有生防潛力的微生物已成為研究的熱門。當(dāng)前從土壤微生物中分離出的被應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中的生防菌有阿維鏈霉菌、芽孢桿菌、淡紫擬青霉等，且由阿維鏈霉菌開(kāi)發(fā)的高效、低毒、廣譜的阿維菌素已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，被廣泛應(yīng)用，發(fā)展前景廣闊。但近年來(lái)從土壤微生物中獲得對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有生防作用菌株的比例逐年下降，而從另一類較新的微生物類群植物內(nèi)生菌中分離出對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有生防作用菌株的研究遭到人們的重視，成為分離獲得植物寄生線蟲(chóng)生防菌的重要來(lái)源。因而，本研究是從植物內(nèi)生菌的分布和種類、分離培養(yǎng)、活性挑選、活性物質(zhì)成分以及防治植物寄生線蟲(chóng)的作用機(jī)理幾方面進(jìn)行綜述，并對(duì)植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲(chóng)的相關(guān)問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了討論，以期為深切進(jìn)入開(kāi)展相關(guān)研究提供參考。1、分布和種類植物內(nèi)生菌〔Endophyte〕指那些在生活史的某個(gè)階段或者全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)的真菌、細(xì)菌或放線菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)外在異常感覺(jué)和狀態(tài)。在當(dāng)前研究過(guò)的所有植物中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌，它們存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等各個(gè)部位。當(dāng)前已報(bào)道的內(nèi)生細(xì)菌超過(guò)129種〔從屬于54個(gè)屬〕，內(nèi)生真菌到達(dá)171個(gè)屬，內(nèi)生放線菌主要為鏈霉菌〔Streptomyces〕、鏈輪絲菌〔Streptoverticillum〕、游動(dòng)放線菌〔Antinoplanes〕、諾卡氏菌〔Nocardia〕、小單胞菌〔Micromonospora〕?？梢?jiàn)，植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的分布具有普遍性和多樣性的特點(diǎn)，這為開(kāi)展植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲(chóng)的研究提供了有利資源。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的具有防治植物寄生線蟲(chóng)作用的內(nèi)生真菌有尖孢鐮刀菌〔Fusariumoxysporum〕、菜豆擬莖點(diǎn)霉〔Phomopsisphaseoli〕、Melanconiumbetulinum、Geotrichumsp.AL4、球毛殼菌〔Chaetomiumglobosum〕等；內(nèi)生細(xì)菌有假單胞菌屬〔Pseudomonassp.〕、嗜麥芽窄食單胞菌〔Stenotrophomonasmaltophilia〕、缺陷短波單胞菌〔Brevundimonasdiminuta〕、枯草芽孢桿菌〔Bacillussubtilis〕等；內(nèi)生放線菌如I07A-01824等。2、分離培養(yǎng)方式方法植物內(nèi)生菌的分離方式方法主要有兩大類：一類為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方式方法；另一類為新近發(fā)展起來(lái)的非培養(yǎng)方式方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法分離植物內(nèi)生菌有很大的局限性，主要?dú)w因于人們對(duì)植物內(nèi)生菌的認(rèn)識(shí)還不夠全面客觀，很多內(nèi)生菌的生長(zhǎng)條件還未確定；其次，在挑選經(jīng)過(guò)中，受培養(yǎng)基選擇性的限制，很多寄生程度高、與寄主植物密切相關(guān)的固有菌會(huì)被漏掉。因而，約有90%-99%的環(huán)境微生物用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無(wú)法進(jìn)行分離。但由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法能夠得到菌株實(shí)體，所以在新物種資源的開(kāi)掘等方面有著不可替代的作用，還是微生物資源開(kāi)發(fā)利用的主要方式方法。研究植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性，多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法。由于分離培養(yǎng)法具有局限性，為了獲得盡可能多的內(nèi)生菌，一般采用多種分離培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行分離。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)學(xué)者在分離內(nèi)生真菌中常用PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等，為了抑制細(xì)菌和其他雜菌的生長(zhǎng)，通常還將選擇性生長(zhǎng)抑制劑參加到分離培養(yǎng)基中；分離內(nèi)生細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨〔NA〕、Luria-Bertani培養(yǎng)基〔LB〕等；分離放線菌常用高氏一號(hào)培養(yǎng)基、黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基等，為防止生長(zhǎng)快的菌種阻止或掩蓋生長(zhǎng)緩慢菌種，營(yíng)養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基也常用于分離內(nèi)生菌。在進(jìn)行植物內(nèi)生菌群落構(gòu)造多樣性研究及種屬鑒定時(shí)常用非培養(yǎng)法。3、活性挑選方式方法在植物內(nèi)生菌殺線蟲(chóng)活性挑選時(shí)，一般采用室內(nèi)離體試驗(yàn)和盆栽測(cè)效試驗(yàn)相結(jié)合的方式方法進(jìn)行。殺線蟲(chóng)毒力測(cè)定和孵化抑制活性測(cè)定主要是觸殺法〔浸漬法〕，即將供試線蟲(chóng)或卵囊放入已配好的內(nèi)生菌發(fā)酵提取物的藥液中，經(jīng)一定時(shí)間處理后，在解剖鏡下檢查線蟲(chóng)死活和被擊倒的情況或孵化率和線蟲(chóng)卵的發(fā)育進(jìn)度。繁衍抑制測(cè)定一般采用藥劑培養(yǎng)基法、棉球法和培養(yǎng)基噴霧法，這3種方式方法的不同之處在于藥劑培養(yǎng)基法是將藥劑與培養(yǎng)基混合制成藥劑培養(yǎng)基，然后再往培養(yǎng)基上接種供試線蟲(chóng)；棉球法是將藥劑和供試線蟲(chóng)注入培養(yǎng)基的棉球上；而培養(yǎng)基噴霧法是將藥液直接噴霧在接種供試線蟲(chóng)的培養(yǎng)基上。忌避活性測(cè)定一般采用藥劑培養(yǎng)基法和棉球法，這里的藥劑培養(yǎng)基法是將培養(yǎng)基配成一定濃度的藥劑培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基完全凝固后，將藥劑培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基分別從各自中間分開(kāi)，然后對(duì)半互換，在培養(yǎng)基上接種菌株，待菌長(zhǎng)滿平板后在分界限的放入脫脂棉球，接種供試線蟲(chóng)，一定時(shí)間后分別取藥劑培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基分離并計(jì)線蟲(chóng)數(shù)；而棉球法是在培養(yǎng)皿的中間和邊緣分別放置脫脂棉球，中間棉球接種線蟲(chóng)，一邊棉球加藥液，一邊棉球加溶劑做對(duì)照，一定時(shí)間后分別檢查兩邊棉球上線蟲(chóng)數(shù)。固然繁衍抑制測(cè)定和忌避活性測(cè)定都用到了藥劑培養(yǎng)基法和棉球法，但在操作上還是有區(qū)別的。利用藥劑培養(yǎng)基法進(jìn)行繁衍抑制測(cè)定時(shí)，培養(yǎng)皿里的藥劑培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基各自是完好的；在進(jìn)行忌避活性測(cè)定時(shí)，培養(yǎng)皿里的藥劑培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基分別從各自中間分開(kāi)，然后對(duì)半互換。利用棉球法進(jìn)行繁衍抑制測(cè)定時(shí)，是將藥劑和供試線蟲(chóng)注入培養(yǎng)基的同一個(gè)棉球上；在進(jìn)行忌避活性測(cè)定時(shí)，是將藥劑和供試線蟲(chóng)注入培養(yǎng)基的不同棉球上。盆栽試驗(yàn)一般采用灌根法或浸根法進(jìn)行研究。灌根法是將一定濃度的內(nèi)生菌發(fā)酵液或菌液灌入植株根區(qū)的一種施藥方式方法；浸根法是將植物根系在一定濃度的內(nèi)生菌發(fā)酵液或菌液中浸泡一定時(shí)間后再移栽的一種施藥方式方法。4、活性物質(zhì)成分對(duì)植物內(nèi)生菌的研究盡管起步較晚，但發(fā)展很快。植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物繁多，當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的主要生物活性物質(zhì)有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、苯丙烷類、有機(jī)酸類、多肽類等化合物。關(guān)于植物內(nèi)生菌殺線蟲(chóng)及其活性物質(zhì)的研究固然也獲得了一定進(jìn)展，但還處于起步階段。一方面，僅有少數(shù)分離自植物內(nèi)生菌的殺線蟲(chóng)化合物被報(bào)道，如乙酸，Pregaliellalactone，3-hydroxypropionicacid，l-〔2，4-dihydroxyphenyl〕-ethanone、1-［〔2R*，4S*，5S*〕-2-chloro-4-methyl-l，3-oxazinan-5-y1］ethanone和1-［〔2R*，4S*，5R*〕-2-chloro-4-methyl-1，3-oxazinan-5-y1］ethanone，ChaetoglobosinA，〔R〕-〔-〕-2-ethylhexan-1-ol和不飽和脂肪酸5，8-二烯十四酸等。另一方面，從桂皮、香蕉、衣索比亞咖啡、黑胡椒、野生大豆等植物中分離出對(duì)植物寄生線蟲(chóng)或卵有毒殺或抑制作用的內(nèi)生菌，但這些內(nèi)生菌殺線蟲(chóng)活性的有效成分尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。5、防治植物寄生線蟲(chóng)的作用機(jī)理植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲(chóng)的機(jī)理研究當(dāng)前還不多，因而，對(duì)其作用機(jī)理還不太清楚，研究者普遍以為主要表如今通過(guò)產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性代謝物質(zhì)影響植物寄生線蟲(chóng)體內(nèi)各種酶和代謝反響，改變根系分泌物影響植物寄生線蟲(chóng)的卵孵化以及線蟲(chóng)的寄生，與植物寄生線蟲(chóng)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間位點(diǎn)影響線蟲(chóng)的侵染，加強(qiáng)宿主植物的抵抗力、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等幾個(gè)方面。5.1產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性代謝化合物線蟲(chóng)體內(nèi)存在有各種水解酶類、氧化復(fù)原酶和轉(zhuǎn)移酶類等，這些酶對(duì)線蟲(chóng)的生存為害有著重要的作用。多數(shù)內(nèi)生菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的影響是通過(guò)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)不同酶系和代謝反響的作用而致使線蟲(chóng)活性下降甚至死亡。李洪濤等初步確定了S506對(duì)線蟲(chóng)的殺傷作用主要是胞外代謝產(chǎn)物。羅紅麗等通過(guò)研究鏈霉菌和諾卡氏菌菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率和幼蟲(chóng)死亡率情況，揣測(cè)菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的拮抗機(jī)制可能與菌株的代謝活性產(chǎn)物有關(guān)。蠟樣芽孢桿菌〔Bacilluscereus〕能產(chǎn)生胞外蛋白酶，水解包括線蟲(chóng)角質(zhì)層和膠原等，造成線蟲(chóng)內(nèi)溶物的泄漏，最終殺死線蟲(chóng)。有些細(xì)菌產(chǎn)生殺線蟲(chóng)毒素，如蘇云金桿菌〔Bacillusthuringiensis〕在代謝經(jīng)過(guò)中產(chǎn)生晶體蛋白毒素，引起線蟲(chóng)腸內(nèi)膜浸透性增大，進(jìn)而毀壞線蟲(chóng)腸道組織，致使線蟲(chóng)死亡。有些植物內(nèi)生細(xì)菌如熒光假單胞菌89B-61〔Pseudomonasfluorescens89B-61〕、泡囊假單胞菌IN884〔BrevundimonasvesicularisIN884〕以及枯草芽孢桿菌的代謝物也能夠防治南方根結(jié)線蟲(chóng)。5.2改變寄主根系分泌物根系分泌物能影響線蟲(chóng)卵孵化、線蟲(chóng)趨向于根的運(yùn)動(dòng)、線蟲(chóng)與寄主的辨別及在根上的寄生與分布。王雪等研究發(fā)現(xiàn)感病大豆品種根系分泌物能刺激胞囊線蟲(chóng)的孵化，而抗病品種根系分泌物對(duì)胞囊線蟲(chóng)的孵化未表現(xiàn)明顯刺激作用。同時(shí)，在研究不同抗性品種根系分泌物對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)趨化性的影響時(shí)還發(fā)現(xiàn)，感病品種根系分泌物對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)了明顯的吸引性。通常一些植物寄生線蟲(chóng)需要寄主植物產(chǎn)生的某種促進(jìn)卵孵化的因子，而特定根圍的微生物可消耗根系分泌物或改變分泌形式，進(jìn)而影響這類線蟲(chóng)的發(fā)育。如WestcotIII等以為，施入銅綠假單胞菌〔Pse-udomonasaeruginosa〕后，小環(huán)線蟲(chóng)的卵很快會(huì)停止發(fā)育，這可能與細(xì)菌影響植物根系的分泌物有關(guān)。5.3競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)具有生防作用的植物內(nèi)生菌施入土壤后，對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的作用機(jī)制可能與線蟲(chóng)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)有關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)，線蟲(chóng)與根的互相辨別是根外表的外源凝聚素與線蟲(chóng)體表糖類之間的互相辨別。也有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)線蟲(chóng)有作用的革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁雙層脂膜上具有結(jié)合植物外源凝聚素的構(gòu)造。從以上兩個(gè)發(fā)現(xiàn)能夠推斷某些革蘭氏陰性菌可能與線蟲(chóng)的生態(tài)位部分重疊而發(fā)生兩者之間的競(jìng)爭(zhēng)排擠，競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果是革蘭氏陰性菌憑借數(shù)量諸多的優(yōu)勢(shì)優(yōu)先占據(jù)線蟲(chóng)的侵染位點(diǎn)，并在根部定殖，消耗根圍營(yíng)養(yǎng)，最終占據(jù)空間位點(diǎn)，間接地減少了線蟲(chóng)侵染率。如Hallmann等研究發(fā)現(xiàn)棉花內(nèi)生細(xì)菌與線蟲(chóng)互相作用經(jīng)過(guò)中，有的內(nèi)生細(xì)菌在線蟲(chóng)侵染部位的種群數(shù)量明顯增加，線蟲(chóng)的侵入可能增加了內(nèi)生細(xì)菌的進(jìn)入位點(diǎn)。5.4誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性植物根際促生菌〔PGPR〕主要通過(guò)誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性來(lái)防治植物病蟲(chóng)害，而熒光假單胞菌是一類能夠引起植物系統(tǒng)抗性的主要類群。用熒光假單胞菌P29、P80菌株和芽孢桿菌Bl菌株誘導(dǎo)白三葉草產(chǎn)生對(duì)胞囊線蟲(chóng)〔Heteroderatrifolii〕的系統(tǒng)抗性，能降低雌蟲(chóng)產(chǎn)卵率或增加雌蟲(chóng)畸形率。銅綠假單胞菌IE-6S+和CHAO兩菌株能誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生高于對(duì)照42％和29％的系統(tǒng)抗性。除此之外，內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌菌株162也能夠誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生抗性，顯著降低南方根結(jié)線蟲(chóng)的感染率。6、問(wèn)題與瞻望植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出促生、抗病蟲(chóng)、加強(qiáng)宿主抗性的作用，隨著我們國(guó)家對(duì)生態(tài)環(huán)境的日益重視，對(duì)植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用一定會(huì)很快到來(lái)。當(dāng)前，固然在防治植物寄生線蟲(chóng)方面獲得了一定成效，但在生產(chǎn)實(shí)踐中還存在一些問(wèn)題，主要包括兩個(gè)方面：一是具有線蟲(chóng)生防能力的植物內(nèi)生菌仍然有很多未知的種類需要挖掘，已經(jīng)知道的具有生防潛力的內(nèi)生菌在田間自然條件下定殖能力差。很多植物內(nèi)生菌的生存和培養(yǎng)條件還不清楚，致使大量的內(nèi)生菌無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室條件下分離培養(yǎng)。大多數(shù)生防菌是在試驗(yàn)條件下挑選鑒定的，與田間自然條件有很大區(qū)別，這些生防菌在田間施用后往往因定殖能力弱而降低生防效果；另一個(gè)是缺乏高效穩(wěn)定的生防菌株。在試驗(yàn)條件下，有的生防菌的防效不錯(cuò)，但在田間施用后，由于田間施用、殘留的農(nóng)藥，種群數(shù)量迅速下降而使防效降低；且當(dāng)前生防菌制劑多為活菌制劑，田間應(yīng)用時(shí)常遭到溫度、濕度、土壤pH值等外界因素的影響而使防效不穩(wěn)定。因而，植物內(nèi)生菌防治植物寄生線蟲(chóng)的研究應(yīng)從下面幾個(gè)方面努力：第一，擴(kuò)大對(duì)殺線內(nèi)生菌資源種類調(diào)查和挖掘，尤其是加強(qiáng)對(duì)具有殺線蟲(chóng)作用新的植物內(nèi)生菌種類的認(rèn)識(shí)，將更多的內(nèi)生菌資源有效地應(yīng)用于線蟲(chóng)防治，進(jìn)一步開(kāi)