ICS65.020.01B05

DB33浙 江 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB33/T963—2015厚皮甜瓜種子純度分子標(biāo)記鑒定方法PurityidentificationofMuskmelonvarietyusingmolecularmarkeranalysis2015-05-07發(fā)布 2015-06-07實(shí)施浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布DB33/T963DB33/T963—2015II前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省種植業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、寧波市種植業(yè)管理總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋慧、王毓洪、張香琴、臧全宇、陸惠斌、張慶、范雪蓮。PAGEPAGE6厚皮甜瓜種子純度分子標(biāo)記鑒定方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于厚皮甜瓜種子純度鑒定。農(nóng)業(yè)1485公告-4-2010 基植及其品分檢測(cè) DNA和下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1品種純度品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示[GB/T3543.5-1995，定義3.2]。3.2雜株某差異位點(diǎn)雜交失敗，該位點(diǎn)純合的單株。3.3雜種一代某差異位點(diǎn)雜交成功，該位點(diǎn)雜合的單株。3.4顯性標(biāo)記位點(diǎn)僅能檢測(cè)顯性等位基因，不能夠區(qū)分純合和雜合基因型的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。3.5共顯性標(biāo)記位點(diǎn)同時(shí)能檢測(cè)出顯性和隱性等位基因，能夠區(qū)分純合和雜合基因型的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。3.6隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）DNA（10TaqDNAPCR3.7簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR），PCR原理PCR試劑除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭┖腿ルx子水。引物RAPDRAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）引物名稱(chēng)、序列及差異片段大小見(jiàn)表1。表1 RAPD引名、列異片大小名稱(chēng)序列（5’-3’）差異片段大?。╞p）RAPD-1ACCTGGACAC1200/1400RAPD-2CCACATCGGT1200/1300RAPD-3ACACCGGAAC1500RAPD-4CCGAACACGG460/550SSRSSR（SimpleSequenceRepeat）引物名稱(chēng)、序列及差異片段大小見(jiàn)表2。表2 SSR物稱(chēng)序及異片大小名稱(chēng)F-序列（5’-3’）R-序列（5’-3’）差異片段大?。╞p）SSR-1CAAAGGGCTACAATAACCATCATAATCACCCTATCTC225/350/400/450SSR-2CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAAC120/130/140/550/600SSR-3TGAAGAGACTACCATCCCCATTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC140/150/320/350瓊脂糖RAPD2（DNA500bp～20000bp）SSR2.5%（DNA40bp～1000bp）。10g/L稱(chēng)取1.0g溴化乙錠（EB），溶于100mL水中。配制和使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套操作并妥善處理廢液。10mol/L稱(chēng)取80.0g氫氧化鈉（NaOH），先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。0.5mol/L（pH8.0）稱(chēng)取18.6g（EDTA-Na2）70mL2解后，冷卻至室溫，用按本標(biāo)準(zhǔn)5.4配置氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。1mol/L（pH8.0）稱(chēng)取121.1（Tris）800mL42mL1000mL103.4kPa（121℃）20min。TE（pH8.0）10mL2mL5.51000mL。在103.4kPa（121）20min。5×TBE稱(chēng)取54g三羥甲基氨基甲烷，27.5g硼酸，先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入20mL按本標(biāo)準(zhǔn)5.5配置的乙二胺四乙酸二鈉溶液，加水定容至1000mL。使用時(shí)用水稀釋成0.5×TBE。稱(chēng)取1100mL0.151g二甲1000.151.5mL的0.150.15%100μL5.54gmL4DNARAPD，100bp～2000bpDNADNASSR50bp～1500bpDNADNAdNTPs將濃度為2.5mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種脫氧核糖核苷酸等體積混合。TaqDNAPCR將TaqDNA聚合酶配制成5U/μL使用。0.01。PCR抽樣厚皮甜瓜種子按照每批次不少于300粒抽樣。取樣抽樣結(jié)束后，播種，待第一片真葉長(zhǎng)至0.5cm～1cm時(shí)，即可單株取真葉樣品，液氮冷凍研磨。DNA按農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010規(guī)定執(zhí)行。PCRPCRPCR34表3 RAPD的PCR反體系試劑終濃度體積（μL）無(wú)菌水/2.572.5mmol/LdNTP0.25mmol/L1.010×buffer1×1.025mmol/LMgCl22.5mmol/L1.0引物5mmol/L0.5mmol/L1.05U/μLTaq酶0.015U/μL0.0310ng/μL模板DNA3.4ng/μL3.4總體積/10表4 SSR的PCR測(cè)反試劑終濃度體積（μL）無(wú)菌水/2.462.5mmol/LdNTP0.2mmol/L1.210×buffer1×1.525mmol/LMgCl23mmol/L1.8上游引物5mmol/L0.5mmol/L1.5下游引物5mmol/L0.5mmol/L1.55U/μLTaq酶0.0133U/μL0.0410ng/μL模板DNA3.33ng/μL5總體積/15PCRRAPD440（93℃15s，40302minPCRPCR726minSSR140（9311min，72℃1minPCRPCR）；721min。PCRPCRPCR20g/L25g/L0.5×TBE100mL5μLEBEB6030min0.5×TBEPCR7μLPCR2μLDNA200A90V2h～3h4cm～5cm電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀或紫外投