多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗?zāi)康牧私釶CR的基本原理，學(xué)習(xí)PCR的基本操作技術(shù)。第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗原理

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其原理如下：將待擴(kuò)增的DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，沿模板5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和延伸反應(yīng)循環(huán)，可使兩引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個模板DNA分子經(jīng)20次循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)106。第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR的基本原理

變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物PCR三步曲變性90～97℃退火45～65℃延伸72℃左右PCR過程第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日(二)

PCR的反應(yīng)過程變性-復(fù)性-延伸多重循環(huán)(n)模板以2En擴(kuò)增短片段以指數(shù)式擴(kuò)增長片段以線性式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長度在P1-P2之間第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等各個領(lǐng)域。它既可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控和研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制的探索及醫(yī)學(xué)鑒定等多方面，也被廣泛運(yùn)用于刑偵物證鑒定、親子鑒定及古分子系統(tǒng)學(xué)研究等其他領(lǐng)域。第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗材料、器材及試劑

待擴(kuò)增的模板DNA；DNA熱循環(huán)儀，電泳儀，電泳槽，臺式離心機(jī)，紫外檢測儀，1.5ml離心管架，移液器，1.5ml離心管，0.2ml離心管，槍頭等。dNTPs，Taq酶，引物一對，10×PCRReactionBuffer，TdH2O第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)體系的五要素：

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶來自水生棲熱菌Thermusaquaticus

良好的耐熱性

Mg2+依賴性無校讀功能第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日dNTP，deoxy-ribonucleosidetriphosphate（三磷酸脫氧核糖核苷）的縮寫。是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。在生物DNA、RNA合成中，以及各種PCR（RT-PCR、Real-timePCR）中第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

1.PCR反應(yīng)⑴PCR反應(yīng)混合液的配制（n為反應(yīng)數(shù)）：

n×2.0μl反應(yīng)緩沖液（即10×PCR反應(yīng)緩沖液

其中含15mMMgCl2）

n×2.0μl

dNTP(2mM,each)

n×1.5μl

引物F(2μM)

n×1.5μl

引物R(2μM)

n×0.1μl

Taq酶(5U/μl)

混勻,取19μl分別加入n個0.2mlPCR管中,各管加入模板DNA1μl,

輕輕用手摔一下.第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日無菌薄壁管中順序加入反應(yīng)體系各成分:

雙/三蒸水

l

10×緩沖液 2.5l

25mmol/LMg2+ 2.5l

4×dNTP 2.0l

50umol/L引物1 2.0l

50umol/L引物2 2.0l

模板DNA 1-2

l

TaqDNA多聚酶 1.0l

25.0l輕彈管壁，使各成分充分混勻！

實(shí)驗操作（1）PCR反應(yīng)體系：

四、實(shí)驗步驟第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日實(shí)驗操作（2）設(shè)定循環(huán)程序:

階一:94℃×3m

階二:(94℃×30s-

55℃×1m-

72℃×1m

)

×25~35循環(huán)階三:

72℃×5~10mPCR反應(yīng)在帶熱蓋的PCR儀上進(jìn)行,大約需要兩個半小時.第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日操作提示1、一切器具均經(jīng)高壓滅菌-烘干-冷卻后使用；2、各試劑小份分裝，-20℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)取；3、酶的取用不離開冰??；取液吸頭、離心管均一次性使用，及時更換；第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日2.PCR產(chǎn)物的檢測

⑶制備1.0%的瓊脂糖凝膠

⑷取5μl

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測儀下觀察,記錄結(jié)果.第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日電泳結(jié)果有無目標(biāo)條帶出現(xiàn)，可判別+/-結(jié)果；根據(jù)條帶寬度和亮度，可直觀判斷擴(kuò)增產(chǎn)量；關(guān)于PCR假陰性、假陽性及非特異擴(kuò)增問題。電泳檢驗PCR結(jié)果、分析與評價第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR擴(kuò)增NGF基因（大鼠）ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacgga

gactccgttc541

accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc

-3’Perim1:(5’)gatcggcgtacaggcagaac(3’)328-347Perim2:(3’)cgcggggtgaacggagtctc(5’)529-548

預(yù)期擴(kuò)增長度：220bp第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp220bp→第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日關(guān)于PCR假陰性、假陽性問題每組PCR都要設(shè)立陰性對照（加無關(guān)DNA，而不是不加DNA），以檢測有無污染；每組PCR都要設(shè)立陽性對照（加肯定的DNA或前次PCR產(chǎn)物），以檢測PCR的效率；對假陰性問題，可通過重復(fù)實(shí)驗排除錯誤、改善反應(yīng)條件（用梯度實(shí)驗選擇復(fù)性溫度）等排查、排除之；假陽性多數(shù)都是模板DNA污染的問題，查實(shí)后必須更換所有試劑；……第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日關(guān)于PCR非特異性擴(kuò)增問題：引物特異性引物純度兩條引物的Tm值模板純度模板二級結(jié)構(gòu)退火溫度（時間）反應(yīng)體系中引物、dNTP、Mg++、模板、Taq酶濃度。第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日實(shí)驗延伸檢索了解PCR的進(jìn)展：逆轉(zhuǎn)錄PCR；巢式PCR；反向PCR；差示PCR；單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR；實(shí)時定量PCR；……

第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆轉(zhuǎn)錄酶特異性引物,Taq酶用途:獲得所需cDNA片段；檢測基因表達(dá)注意問題：1、PCR效率差異，重復(fù)性2、內(nèi)參選定3、共同擴(kuò)增4、擴(kuò)增片段位置5、mRNA豐度第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日巢式PCR采用兩對引物進(jìn)行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)P1上P1下P2上P2下用途：驗證第一次PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行特殊PCR，如合成探針模板第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日差示PCR（DD-PCR)

利用特殊設(shè)計的引物，在RT的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR，以研究不同基因的表達(dá)狀況。腫瘤組織正常組織第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(SSCP-PCR)第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR引物設(shè)計一對引物，分別與靶DNA5’和3’端互補(bǔ)長度：15～30個核苷酸引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無同源性引物的設(shè)計可以參照：兩分鐘StepByStep學(xué)會引物設(shè)計軟件

Primerpremier5.0/oligo軟件

核酸基因技術(shù)討論版/生物信息學(xué)討論版/PCR技術(shù)討論版第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日引物設(shè)計：1.長度在15-30bp，GC含量在45-55%之間。

Tm=4(G+C)+2(A+T)。2.堿基分布表現(xiàn)出隨機(jī)性，避免相同堿基連續(xù)排列。3.3’不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級結(jié)構(gòu)。4.兩個引物各自的3’不能互補(bǔ)，以免形成自身擴(kuò)增。5.引物必須經(jīng)GenBank查詢后，證實(shí)沒有與其他非目的DNA高度互補(bǔ)，才能使用。第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日使用blast程序，輸入引物序列，等待結(jié)果報告。GenBank網(wǎng)址：第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日primer/primer3_www.cgi

引物設(shè)計網(wǎng)址：第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR的反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將pg=10-12級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(g=10-6)水平簡便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時完成擴(kuò)增反應(yīng)對標(biāo)本的純度要求低：

DNA粗制品可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等擴(kuò)增檢測第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日五、注意事項

⑴使用的全部溶液都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染.⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是最高質(zhì)量的三蒸水.⑶

所有試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后再分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保每次擴(kuò)增實(shí)驗之間的一致性.第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

普通高中課程

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗教科書 生物

選修1生物技術(shù)實(shí)踐

第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日專題4DNA與蛋白質(zhì)技術(shù)

課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課程標(biāo)準(zhǔn)具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)

嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作和應(yīng)用

?；顒咏ㄗh

用某一DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日課題2

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段教材內(nèi)容:

基礎(chǔ)知識

(一)PCR原理

(二)PCR的反應(yīng)過程

實(shí)驗操作

操作提示

結(jié)果分析與評價

課題延伸

練習(xí) 第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、課題目標(biāo)本課題通過嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作，使學(xué)生體驗PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗方法，理解PCR的原理，討論P(yáng)CR的應(yīng)用教材分析第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)

課題重點(diǎn)：

PCR的原理和PCR的基本操作。課題難點(diǎn)：

PCR的原理。教材分析第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、課題背景分析課題背景首先介紹了PCR是一種在體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，然后說明這一技術(shù)在遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆等方面都有著廣泛的應(yīng)用，最后指出本課題的目標(biāo)是了解PCR技術(shù)的基本原理，并嘗試用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段。教師在導(dǎo)入本課題的學(xué)習(xí)時，可以先讓學(xué)生談一談對PCR的認(rèn)識以及PCR的應(yīng)用，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，然后再說明本課題的目標(biāo)。教材分析第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)建議

（一）PCR原理知識要點(diǎn)：

1.細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成 成分與反應(yīng)條件；

2.DNA的合成方向；

3.TaqDNA聚合酶的應(yīng)用。教材分析第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）PCR原理教學(xué)建議：

理解PCR的原理，需要首先了解細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件。教師在教學(xué)過程中，可以首先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2《遺傳與進(jìn)化》中的有關(guān)DNA復(fù)制的知識。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生需要進(jìn)一步了解DNA雙鏈的方向，能夠區(qū)分DNA的3′端和5′端。此外，學(xué)生還需要了解DNA聚合酶的特性，如只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈、而不能從頭合成DNA等。教學(xué)建議第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）PCR原理教學(xué)建議：TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化，是一個重要的知識點(diǎn)。教師可以結(jié)合專題2中課題2“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)”Taq細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過程，幫助學(xué)生加深理解。教學(xué)建議第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）PCR的反應(yīng)過程知識要點(diǎn)：

PCR的基本步驟及每個步驟所發(fā)生的變化。教材分析第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）PCR的反應(yīng)過程教學(xué)建議：這部分內(nèi)容的教學(xué)應(yīng)以讀圖識圖為主。教科書中圖5-9“PCR反應(yīng)過程圖解”詳細(xì)地描繪了參與PCR的各組成成分；每一輪反應(yīng)的三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸；每一輪中每一個步驟所發(fā)生的變化，即每個步驟所具有的作用。教師在教學(xué)中可以請學(xué)生在讀圖的同時，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時，教師要及時給予解答。教學(xué)建議第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日(一)PCR原理體內(nèi)DNA復(fù)制:模板DNA原料:dNTP酶:解旋酶、DNApol.

…起始引物、合成方向合成環(huán)境…第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日解鏈→模板變性引物-起始→引物-模板復(fù)性子鏈延伸→子鏈延伸(一)PCR原理第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日Hotwaterbacteria:

ThermusaquaticusTaqDNApolymeraseLifeatHighTemperaturesbyThomasD.BrockBiotechnologyinYellowstone?1994YellowstoneAssociationforNaturalScience第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日加樣器的使用第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日結(jié)果分析與評價此為紫外光吸收檢測的結(jié)果檢驗法，實(shí)踐中很少用；

普遍采用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗PCR結(jié)果第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日網(wǎng)站鏈接北大生物信息中心

生物通

生物谷

中華基因網(wǎng)

中國生物論壇

生物引擎基因中國

……

第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日PCR應(yīng)用相關(guān)文章及鏈接：PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR促進(jìn)新藥研發(fā)

火眼金睛——PCR技術(shù)

DNA出庭作證

AnimationofmolecularbiotechBiologyAnimationLibrary

第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日MolecularGeneticMethods-LectureTopics

ChapterPolymeraseChainReaction(PCR) 7DNAsequencing(manual/automated) 7DNAFingerprinting(DNAtyping/profiling) 8Singlenucleotidepolymorphisms(SNPs) 9第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日PracticalapplicationsofPCR,Sequencing,Fingerprinting,&SNPs:AmplifyDNAforCloning(PCR)AmplifyDNAforsequencingwithoutcloning(PCR)DNAsequencingreaction(PCR)MappinggenesandregulatorysequencesLinkageanalysis(identifygenesfortraits/diseases)DiagnosediseasePathogenscreeningSexdeterminationForensicanalysisPaternity/maternity(relatedness)Behavioralecologystudies(relatedness)Molecularsystematicsandevolution(comparinghomologoussequencesindifferentorganisms)Populationgenetics(theoreticalandapplied)Physiologicalgenetics(studyingbasisofadaptation)Livestockpedigrees(optimizebreeding)Wildlifemanagement(stockidentification/assessment)DetectionofGeneticallyModifiedFood(GMOs)第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日BackgroundonthePolymeraseChainReaction(PCR)AbilitytogenerateidenticalhighcopynumberDNAsmadepossibleinthe1970sbyrecombinantDNAtechnology(i.e.,cloning).CloningDNAistimeconsumingandexpensive(>>$15/sample).Probinglibrariescanbelikehuntingforaneedleinahaystack.PCR,“discovered”in1983byKaryMullis,enablestheamplification(orduplication)ofmillionsofcopiesofanyDNAsequencewithknownflankingsequences.Requiresonlysimple,inexpensiveingredientsandacouplehours.DNAtemplatePrimers(annealtoflankingsequences)DNApolymerasedNTPsMg2+BufferCanbeperformedbyhandorinamachinecalledathermalcycler.1993:NobelPrizeforChemistry第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日HowPCRworks:BeginswithDNAcontainingasequencetobeamplifiedandapairofsyntheticoligonucleotideprimersthatflankthesequence.Next,denaturetheDNAtosinglestrandsat94?C.RapidlycooltheDNA(37-65?C)andannealprimerstocomplementarys.s.sequencesflankingthetargetDNA.Extendprimersat70-75?Cus