第十二章酶技術專業(yè)：發(fā)酵工程第一節(jié)酶生物合成的調節(jié)技術操縱子學說（雅格和莫諾德，1960年）酶的生物合成是在基因的控制之下進行的。這些基因包括調節(jié)基因（regulatorgene）、啟動基因（promotergene）、操縱基因（operatorgene）和結構基因（structuralgene）。他們在DNA分子中按一定的次序排列，啟動基因、操縱基因和結構基因一起被稱作操縱子（operon）。調節(jié)基因：可以產生一種阻遏蛋白。啟動基因：決定酶的合成能否進行。操縱基因：可以與調節(jié)基因產生的阻遏蛋白結合，從而操縱酶生物合成的時機和合成速率。結構基因：決定合成某一種蛋白質或RNA分子結構相應的一段DNA。（一）酶合成的誘導通過添加某種物質，可使酶的合成開始或加速進行，這種作用稱為誘導作用。能夠引起誘導作用的物質稱為誘導物。如：乳糖酶的誘導一、酶合成的調節(jié)機制1誘導物的選擇誘導物可分為三類(1)酶的作用底物如：大腸桿菌生產β-半乳糖苷酶(2)酶的反應產物如：纖維二糖對纖維素酶有誘導能力(3)酶的底物類似物(最有效的誘導物)如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷對β-半乳糖苷酶的誘導2酶誘導合成的條件(1)基因必須完整。酶的合成是在基因的控制下進行的，若基因受到破壞或變異，酶的合成將受影響。①若酶所對應的結構基因改變，該酶將無法合成。②若同一操縱子中，第一位的結構基因受破壞，則第二位及其以后的各個結構基因及時完好，也無法合成相應的酶。③若操縱基因變異，將出現(xiàn)兩種相反的情況：一是操縱基因變異后，阻抑蛋白不能與之結合，那么將不受誘導物或阻遏物的影響，酶都可以合成；二是操縱基因變異后，與阻抑蛋白牢固結合，是否有誘導物，酶均無法合成。④若調節(jié)基因變異，不能合成相應的阻抑蛋白，那么也不受誘導物或阻遏物的影響。(2)阻抑蛋白本來與操作基因的親和力強，兩者原來結合在一起，使酶不能合成。當添加誘導物時，誘導物與阻抑蛋白結合，使其與操作基因分離，才能進行酶的合成。(3)在添加誘導物時，細胞處于環(huán)境中，不能有高濃度的分解代謝阻遏物或其他強阻遏物存在，否則將無法誘導。（如乳糖和葡糖糖）3酶誘導合成的檢測

(1)胞外酶：在誘導一定時間后，每隔一定的時間取一定量的培養(yǎng)基連同細胞一起測定酶活力，同時測定細胞的量。計算單位細胞量的酶活力，再與不添加誘導物的數(shù)值對照，可知誘導效果如何。(2)胞內酶：在添加誘導物后，每隔一定的時間取一定量的細胞，破碎，測定酶活力，算出單位細胞量的酶活力。與不添加誘導物的數(shù)值對照，可知誘導效果如何。二、酶生物合成的阻遏1阻遏作用的分類酶生物合成的阻遏作用有產物阻遏和分解代謝阻遏（1）產物阻遏作用產物阻遏是由于產物與阻遏蛋白結合后，使原來不與操作基因結合的阻遏蛋白變構，而與操縱基因結合在一起，使酶的合成受阻。如：色氨酸操縱子酶阻遏（圖）(2)分解代謝物阻遏作用分解代謝物阻遏作用是指某些物質(主要是指容易利用的碳源)經過分解代謝產生的分解代謝物阻遏某些酶(主要是誘導酶)生物合成的現(xiàn)象。分解代謝物阻遏作用與環(huán)腺苷酸（cAMP）的濃度有關。如下圖2酶合成的阻遏與解除阻遏作用(1)使酶的合成受阻在細胞進行酶合成的過程中，添加一定量的阻遏物，如：末端產物、反應產物或葡萄糖等容易利用的碳源。(2)使酶合成的阻遏作用解除必須除去阻遏物，控制阻遏物的含量或添加cAMP.3酶阻遏作用與解除阻遏合成的檢測方法一：在酶合成的過程中，添加不同量的阻遏物，然后每隔一段時間，取樣分析酶活力和細胞量，與空白試驗進行對照，即可檢測該物質的阻遏效果。方法二：將細胞從含有阻遏物的培養(yǎng)基中取出，洗凈后，重新在含有阻遏物和不含阻遏物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再比較兩者的酶活力和細胞量，亦可檢測阻遏物的阻遏效果，并看到解除阻遏合成。第二節(jié)酶反應動力學的研究一、酶反應初速度的測定酶催化反應速度：用單位時間內底物的減少量或產物的增加量來表示。一般多采用單位時間內產物的增加量來表示。測定酶反應速度的步驟：(1)根據酶的催化專一性，選擇適宜的底物；(2)根據文獻資料或初步試驗結果，確定酶反應的溫度和pH條件，溫度亦可選在25℃(3)在一定條件下，將一定量的酶液加到底物中，開始反應，記錄時間。(4)每隔一定時間，取出適量的反應液測定產物生成量或底物減少量。時間間隔開始階段可以短些，后期可間隔長些。(5)以反應時間為橫坐標，產物生成量或底物減少量為縱坐標作出酶反應過程曲線。AOBC時間產物生成量反應初期直線斜率即酶反應初速度酶反應過程曲線二底物濃度對反應速度的影響VVmVm/2Km[s]酶濃度一定時底物濃度對反應速率的影響Km和vmax的測定如果根據上圖求出Km和vmax，常常要測定許多不同底物濃度下的反應速度才能確定。為了方便起見，常常采用其他圖解法求得Km和vmax。常用的有雙倒數(shù)作圖法和但倒數(shù)作圖法等。

單倒數(shù)作圖法

縱軸截距：橫軸截距：斜率：伊蒂-霍夫斯第法

縱軸截距：橫軸截距：斜率：三最適溫度、熱穩(wěn)定性和活化能的測定1最適溫度測定任何酶反應都有一個最適溫度范圍。在測定時，只要把其他的反應條件固定，只改變反應溫度，通過測定不同溫度下的反應速度，以溫度為橫軸，以酶反應速度為縱軸繪圖，就可以得出反應最適溫度。如圖：

2熱穩(wěn)定性測定時間方法一：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，在不同的溫度下（一般選用40℃以上的溫度），測定相同時間內酶反應速度，計算出不同溫度下相對酶反應速度。方法二：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，測定在某一較高溫度下不同時間的酶反應速度，以反應時間為橫坐標，反應速度為縱坐標，繪出曲線。如圖3活化能測定斜率=-0.219Ea1/TlgK取對數(shù)積分、化為常用對數(shù)式中：Ea—活化能K1、K2——分別為溫度為T1、T2時測得的酶反應速度常數(shù)阿累尼烏斯方程pH值四最適pH值的測定一種酶表現(xiàn)出最高催化活性時的pH值稱為該酶的最適pH值。通過測定不同pH條件下酶的催化反應速度，就可以找出其最適pH值。五酶的激活與抑制添加某種物質后，使酶的催化活性增強的現(xiàn)象，稱為酶的激活作用。起激活作用的物質稱為激活劑。凡是使酶的催化活性減低的現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。起抑制作用的物質稱為抑制劑。酶的抑制作用競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制根據抑制劑[I]與酶[E]的結合方式，可以分成三種酶抑制作用的類型KI—抑制劑的解離常數(shù)（mol/l）可以看出，競爭性抑制動力學的主要特點是米氏常數(shù)值Km的改變，Vmax不受競爭性抑制劑的影響。根據穩(wěn)態(tài)學說競爭性抑制曲線：抑制劑濃度[I]增加時，