HIV分子流行病學及其應用廣東省疾病預防控制中心/廣東省公共衛(wèi)生研究院何翔分子流行病學2分子流行病學是一門采用分子生物學指標和技術手段來進行流行病學調(diào)查研究的科學，并涉及到多個新學科，包括生物信息學、分子生物學和數(shù)學(計算科學)就研究對象而言，傳統(tǒng)意義上的流行病學主要研究宿主，而分子生物學方法主要研究病原體分子流行病學的早期定義中，包括無機分子和有機分子(如糖分子、蛋白質(zhì)、抗體和核酸)，隨著測序技術的快速發(fā)展，現(xiàn)在的分子流行病學更多的利用蛋白質(zhì)和核酸信息隨著測序技術的發(fā)展、計算能力的提高及新出現(xiàn)的病毒，分子流行病學的應用將更加廣泛HIV分子流行病學常用的方法3分子生物學技術與現(xiàn)場流行病學研究方法相結合基因序列分析異源雙鏈泳動分析（HMA)單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP)核酸探針雜交/特異性引物檢測HIV分子流行病學研究的主要內(nèi)容4HIV的種類及分布HIV的起源和進化分子流行病學調(diào)查：地區(qū)HIV流行毒株的種類及人群/地域分布特征鑒定和研究新重組病毒的發(fā)生和傳播研究影響不同地域流行HIV的流行病學因素HIV傳播網(wǎng)絡的追蹤(傳播鏈)進化分析的基本概念5HIV-1：人類最大遺傳變異的病原體6迅速復制~10.3x109virionsperday高突變率~1substitutionpergenomeperround重組~7-30crossoverspergenomeperround高度相關但不一致病毒基因組:準種(quasispecies)EVOLUTION/進化靈長類動物的進化系統(tǒng)進化樹Node節(jié)點包括內(nèi)部節(jié)點和外部節(jié)點，外部節(jié)點又稱為OTU(OperationalTaxonomicUnit)，內(nèi)部節(jié)點又稱為HTU(HypotheticalTaxonomicUnit)Branch分支連接節(jié)點Cluster簇一組屬于同一分支的分類單元如果具有單一起源，即稱為簇Root根指的是進化樹上最老的一個點或相信是距離分析的序列進化關系最遠的一組序列(outgrouprooting)Root根Node節(jié)點Branch分支Baldauf.2003.TRENDSinGenetics,19(6):345-351系統(tǒng)進化分析的驗證－瑞典HIV傳播鏈10*maximumlikelihoodanalysisunderaGTR(general-time-reversible)nucleotidesubstitutionmodelPNASUSA,93:10864,1996HIV的變異及分類11HIV的分類：型、組、亞型和重組亞型12型別

亞型組別亞亞型重組亞型HIV24961…………Gaoetal.,Nature,1999Santiagoetal.,Science,2002Corbet,JVirol,2000Foley&Korber

HIVDatabasex50%35%~15-25%靈長類慢病毒的遺傳多樣性HIV-1組別14(2009,NatureMedicine)HIV-1亞型,亞亞型,重組體15A1GBDCF1HKJF2A2CRF01_AECRF02_AGCRF03_ABCRF04_cpxCRF05_FDCRF06_cpxCRF09_cpxCRF08_BCCRF07_BCCRF10_CDCRF11_cpxCRF12_BFCRF13_cpxCRF14_BGCRF15_01BCRF16_A2DCRF17_A2D0.1015系統(tǒng)進化樹分類的標準：亞型vs重組1616系統(tǒng)進化樹分類的標準:CRF17ChiangMaiBangkokRayongB_MNB_RL42B_RFD_ELID_NDKF_VI850F_F9363C_BR025C_ETH2220H_VI991H_CF056A_UG037E_TH253BE_OUR1332BE_KWAN207BE_R2399G_G6165G_HH8793J_SE9173_3J_SE9280-9.10BDHACRF01_AECRF15_01BGJCFFourrecombinantstrainsofidenticalstructurerecoveredfromwidelyseparatedlocationsinThailandestablishedCRF15in2003GP41GP1200102030405060708090100‘E’‘E’Bgagpolenv17系統(tǒng)進化樹分類的標準:URFKenya18ACDADADADADADADACACACAGKER2017KER2021KISII5003KSM4015KSM4017MSA4071KSM4028KNH1097MSA4080KISII5011KNH1043MSA4077CDInEastAfrica,illustratedbythisdatafromKenya,URFformasubstantialproportionofstrainsAURF18HIV亞型及變異19HIV的起源及傳入人群20HIV的起源：SIV的人畜共患感染（跨物種傳播）21非人靈長類動物與人類之間發(fā)生跨物種傳播的證據(jù)病毒基因結構的相似性

Geneticsimilarityofviralgenomes

進化關系的相近性

Closenessofphylogeneticrelationship

自然宿主的感染率

Infectionratesinnaturalhost

地理分布的一致性

Coincidenceofgeographicaldistribution

感染途徑的可能性

PlausiblepathwaysoftransmissionvpuissharedwithHIV-1andSIVCPZvpxisfoundonlyinHIV-2andSIVSM2122靈長類慢病毒的進化史對HIV-1而言，至少發(fā)生了4次跨物種傳播，形成了HIV-1的M組、N組、O組和P組；而HIV-2至少發(fā)生了3次跨物種傳播動物跨種傳播從猿到人的證據(jù)23HIV-1M和N組起源于喀麥隆黑猩猩24提取RNA:所有免疫印跡測定陽性;31/34env(390bp)和pol(890bp)RT-PCR擴增;近期感染Science,313:523,20064/16全長序列分析喀麥隆東南和中南棲息的黑猩猩分別是HIV-1M組和N組病毒的來源SIVcpz是HIV-1的祖先25Science,313:523,2006HIV-1M和N組起源于喀麥隆黑猩猩HIV-1O組可能起源于喀麥隆大猩猩26

檢測喀麥隆偏遠原始森林區(qū)378黑猩猩和213大猩猩糞便標本抗體

40/323P.t.troglodytes（+）；0/55P.t.vellerosus（-）；

6/213野生大猩猩（+）?。?！HIV-1gp41（重組免疫檢測），

HIV-1gp160/gp120，gp41和Pol（p66，p51）（WB）；

提取糞便RNA：所有抗體陽性大猩猩標本

RT-PCR：pol（890bp），env（390bp），env/nef（740bp）系統(tǒng)樹分析大猩猩病毒序列與HIV-1O組非常擬合Nature444:164,2006跨物種傳播是如何發(fā)生的？27沿著商業(yè)/伐木道路的獸肉交易獸肉交易的副產(chǎn)品：寵物猴煙熏肉非人靈長類動物的獸肉28HIV-1M組病毒進入人類的時間Science288:1789-96,2000Nature455:661-4,2008提示HIV-1M組病毒的共同祖先株存在于1930sHIV-1:來源于黑猩猩和大猩猩的免疫缺陷病毒29SIVcpzPantroglodytesHIV-1中部非洲人群

黑猩猩至少發(fā)生四次獨立的傳播事件形成了HIV-1M,N,O，P組.Gorillagorilla

大猩猩HIV-2:來源于烏白眉猴的免疫缺陷病毒(SIVsm)30烏白眉猴關養(yǎng)的獼猴西部非洲人群艾滋病流行的起源和傳播31HIV亞型的地域分布3232HIV傳播和流行33HIV-1M組病毒是造成全球大流行的主要毒株，至今感染了約6000萬人HIV-1O組病毒感染了約10,000人N和P組病毒感染人數(shù)遠少于M組和O組HIV-2主要分布于西部非洲，全球HIV-1亞型分布34(AIDS2011,25:679-689)我國HIV亞型分布（1996-2002年）35我國HIV-1基因型的組成在調(diào)查中檢測到包括A，B，B’，C，G，01_AE，02_AG，06_cpx，07_BC和08_BC在內(nèi)的10種亞型和流行重組毒株；07_BC、01_AE、08_BC和B’毒株等4種基因型是我國主要流行的HIV-1毒株，占2006年報告感染者人數(shù)的92.8%；存在6種gag和env基因片段不一致的毒株，其中部分毒株在不同省份檢測到，可能已開始流行。36CRF07_BCCRF08_BCCRF01_AEB’我國不同人群中HIV亞型分布靜脈吸毒和異性傳播為2006年HIV感染者中最主要的傳播途徑，分別占報告HIV感染者總數(shù)的50.4%和34.7%；其他傳播途徑包括血源相關傳播（占3.8%，包括既往獻血和輸血）、男男同性戀（占2.1%）、母嬰傳播（占0.9%）、其他（占0.4%）和不詳（占7.8%）。IDU人群中以07、08和01為主，分別占48.5%、23.6%和21.2%；異性傳播中種類最多，包括檢測到的12種基因型，01、07、08和B’最多，分別占39.8%、21.9%、17.6%和11.6%；男男同性戀中以01_AE（55.8%）為主，超過以前調(diào)查中的歐美B（21.5%）；血源相關的感染者中以B’為主，占92.5%。37我國HIV-1基因型的分布38我國主要HIV基因型的地理分布39小結我國存在至少12種HIV-1基因型，其中四種為主要流行毒株病毒多樣性在我國不同人群和地區(qū)中形成了不同的流行特征不同地區(qū)病毒多樣性的差異導致病毒傳播驅(qū)動模式的區(qū)別HIV基因型組成和感染者人群轉變說明了我國HIV傳播模式的變化未來我國HIV流行將呈現(xiàn)出更加復雜的狀況與早期結果比較，本次調(diào)查檢測到的HIV-1基因型種類、數(shù)量和分布地域均有所增加40我國主要的HIV基因型是如何起源、傳播和流行的？問題：41B’的起源和傳播42AIDS2012,26:877–884B’毒株的流行云南IDU流行的B’毒株與既往獻血員中流行的B’毒株存在差別，形成2個不同的進化簇；既往獻血員人群中流行的B’毒株來源于云南，而云南B’亞型來源于緬甸；目前在我國多數(shù)省份獻血員人群中流行的B’毒株已通過異性傳播擴散到其他人群；云南地區(qū)B’毒株的流行起始時間為1985年左右，我國中部地區(qū)獻血員人群中HIV-1的流行起始時間為1989年。43AIDS2012,26:877–884B’毒株在中國的傳播B’TH

1983(1980-1985)B’YN1985(1982-1987)B’CN*1989(1987-1991)尚存的幾個疑問：B’是如何從泰國到達中國境內(nèi)的？緬甸是否是其傳播的一個環(huán)節(jié)？B’YN毒株是否僅在云南德宏州出現(xiàn)，未在其他地方流行？即B’YN和B’CN*的邊界問題。云南省內(nèi)B’CN*的起源及其與中部省份B’的相互關系？各省之間傳播的時序關系？各省不同人群間傳播的時序關系？性傳播在其中起到什么作用？44CRF01_AE的起源和傳播45GeographicsourceSamplingyearnRiskgroup

HeteroIDUMSMNAChina

102(27)58(21)20(4)186Beijing201013

13

Fujian2005-200722(12)20(11)1(1)

1Guangdong20071045

1Guangxi1997-200725(14)17(10)8(4)

Guizhou2007622

2Hunan20102

2Jiangsu20075(1)41(1)

Jilin201042

2

Liaoning200731

2

Sichuan2006211

Tianjin20071

1

Yunnan2002-2009972

Afghanistan20071(1)

1(1)Central

Africa19903(3)

3(3)Hong

Kong

20041(1)

1(1)Indonesia19931(1)

1(1)Japan19931(1)1(1)

Thailand

1993-200449(49)

49(49)UnitedStates1998-20003(3)

3(3)Vietnam1997-199833(33)17(17)16(16)

Total

194(119)76(39)36(22)1864(58)CRF01_AE的流行我國至少存在7個獨立的進化簇所有的CRF01_AE進化簇均于20世紀90年代中期從東南亞傳入我國多個地區(qū)。46不同流行簇的地理分布47簇1、2和3主要在華南和西南省份的異性傳播和靜脈吸毒人群中流行簇4和5主要在北方的主要城市中的男男同性戀人群中流行簇6和7則分別在福建和云南的異性傳播人群中流行CRF01的傳入與出境旅游可能有一定關聯(lián)48CRF01_AE在中國的傳播CRF01_AE1985CRF01_AE1995s一些想法：早期樣本較少，造成CRF01_AE各流行簇如何形成的過程不清楚；目前的時間更多體現(xiàn)了各簇形成的時間，不排除傳入時間更早的情況就目前的結果看，80年代中期即有少量CRF01_AE進入我國，只是到了90年代中期才隨著性傳播的快速流行形成各流行簇？是否可使用更短的序列研究起源？49AfricaCRF07_BC/CRF08_BC在中國的傳播50

JVirol2008,82:9206-9215CRF07_BC在亞洲的傳播51

JVirol2008,82:9206-9215CRF08_BC在亞洲的傳播52

JVirol2008,82:9206-9215小結我國HIV的基因類型和流行模式的多樣性越來越復雜B’、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC毒株均存在多個進化簇的流行，其原因除了多個HIV病毒株從境外傳入我國，例如多個CRF01_AE毒株幾乎同時從東南亞傳入我國，也包括某個HIV病毒在局部的特定人群中流行與快速傳播，例如CRF08_BC在廣西不同地區(qū)形成進化簇，而CRF07_BC和多個CRF01_AE毒株均在男男同性戀人群中形成單獨的進化簇隨著我國HIV感染者中通過性傳播比例的持續(xù)增加，可以預期我國HIV流行毒株的種類和數(shù)量將進一步增加，病毒的流行特征也將更加趨于復雜。復雜的HIV流行狀況將對我國的檢測試劑研發(fā)、抗病毒治療和與核酸檢測相關的新技術研究和應用都帶來巨大的挑戰(zhàn)。53HIV傳播途徑的追蹤(傳播鏈)54系統(tǒng)進化樹分析已被證明是提供HIV-1傳播史(鏈)證據(jù)的最有用的方法（流行病學目的和法律案件的分析）分子流行病學在犯罪引起感染分析的中應用55

美國加州拉斐特胃腸道醫(yī)生，將來自于他的HIV感染病人的血液或血液制品注射給他的前女友；分析受害者和病人以及當?shù)豀IV-1感染者的HIV-1RT和env序列；結論：受害者和病人的HIV-1RT和env序列極其相近，二者的HIV-1

RT序列中由AZT引起的耐藥突變序列也非常一致；罪犯被判為二級謀殺罪。美國第一次在法院使用系統(tǒng)進化樹分析由犯罪造成的HIV感染案例PNAS2002,99:14292-14297gp120RTMinimumevolutionbootstrap:100Parsimonybootstrap:96%Bayesianposterior:100100%100%病人受害者Lafayette對照AZTR序列0.00-1.45%0.15-1.52%2.61-6.75%AZTs序列0.44-1.23%1.60-2.61%3.19-6.53%563個MSMA,B,CHIV-1耐藥株5年內(nèi)傳播鏈RT耐藥突變位點繼續(xù)穩(wěn)定的傳播在1個MSM中持續(xù)至少4年MSMC血液HIV序列與MSMB精液HIV序列更相似

91年感染，92年AZT治療，95年死亡94年感染，97年與C有性關系，D4T/3TC，RTV/SQV/d4T治療98年2-9月被B感染確定傳播方向：WashingtonCases57polenv確定傳播方向：TexasCases58polenvCC01:02,03,04,06,07CC01:02,03,04,05,06,07序列信息與時間的相關分析59606162利比亞醫(yī)務人員傳播艾滋病毒事件63簡單歷史回顧641998年3月：5名保加利亞護士和1名巴勒斯坦醫(yī)生進入醫(yī)院1998年：利比亞第二大城市班加西的法塔赫醫(yī)院爆發(fā)426名兒童因輸血感染艾滋病，死亡50多人1999年：5名保加利亞護士和1名巴勒斯坦醫(yī)生被指控涉嫌用利比亞兒童做實驗品，導致這些兒童全部感染艾滋病病毒2004年5月：當?shù)胤ㄔ号刑幧姘傅?名醫(yī)護人員死刑2006年：迫于西方壓力，利比亞最高法院宣布重審2006年12月6日：Nature在線快速通道發(fā)表科學文章證明其無辜2006年12月19日：利比亞最高法院維持原判2007年7月17日：利比亞最高司法委員會將死刑改判為終身監(jiān)禁一周后，6名醫(yī)護人員被引渡回國后獲得赦免64流行病學證據(jù)65在2003年4月，在法庭的要求下，由2名國際HIV/AIDS科學家，LucMontagnier和VittorioColizzi組成班加西事件研究組對在班加西市HIV-1爆發(fā)事件進行了科學調(diào)查。在提交的報告中他們提供了大量流行病學證據(jù)：在1997年以前該醫(yī)院即收治過HIV感染兒童；在1999年6名外國醫(yī)務人員離開后，該醫(yī)院繼續(xù)有3名兒童被感染；大量被感染兒童收治時間在1998年以前，且部分兒童到醫(yī)院后的血清陽轉時間少于1個月，說明感染時間可能在1997年甚至于更早。而分子流行病學的證據(jù)也表明，在該醫(yī)院引起爆發(fā)的HIV病毒與1997年或1999年在該院傳播的病毒極為相似，具有共同的起源；與非洲部分地區(qū)流行的HIV病毒株也很相似，推測該院爆發(fā)的HIV病毒來自于非洲亞撒哈拉地區(qū)。該報告結論：在該醫(yī)院中存在乙肝和丙肝病毒很高的感染率，HIV病毒爆發(fā)更象是醫(yī)院不規(guī)范的醫(yī)療活動造成，在6名國外醫(yī)務人員到達以前，HIV-1和HCV已在該醫(yī)院流行。流行病學證據(jù)66HIV-1和HCV在1998年3月外國醫(yī)生來到之前在這家醫(yī)院及其市郊已經(jīng)流行44個HIV-1gag

基因序列和61個HCVE1/E2基因序列，進行進化分析確定爆發(fā)傳播史的真實時刻表使用所有與該醫(yī)院傳播毒株極其相似的參考序列和使用貝葉斯方法和最大似然性方法估計和評價種系發(fā)生醫(yī)院傳播株序列在CRF02_AG簇中形成了一個非常完整的單元簇，表示醫(yī)院爆發(fā)病毒來自于一個CRF02_AG種系該簇序列與3個西非參考序列接近，可以認為醫(yī)院傳播株是從西非傳入利比亞系統(tǒng)樹分枝至醫(yī)院傳播株的長度非常典型，因此醫(yī)院傳播株不是異常的分歧進化病毒HIV-1自然傳人利比亞，與流動人口有關Nature2006，444：65866分子流行病學證據(jù)證明六名醫(yī)務工作者無辜67三個進化簇：11個HCV4a亞型（埃及流行株）；22個HCV4型（喀麥隆流行株）；24個HCV1a亞型全球流行株）67分子流行病學證據(jù)證明六名醫(yī)務工作者無辜68該醫(yī)院感染者中獲得的4個不同病毒（包括1株HIV和3株HCV）流行史分析結果表明，這4株病毒傳入該院的時間均在1998年3月以前，其傳入該院時間在1998年3月1日以后的概率幾乎為0。

HCV簇比HIV-1簇起始早，支持該醫(yī)院存在醫(yī)源性傳播的結論并表明該醫(yī)院存在長期的傳染病控制問題在爆發(fā)中流行的HIV和HCV毒株在1998年3月以前已經(jīng)擴散并流行，這表明在傳染鏈中的多個病毒傳播在外國醫(yī)務人員到達以前就已出現(xiàn)68--傳播途徑--地理信息--人口遷移--不同分區(qū)--道路、距離等序列信息與其他信息的相關性分析70GeneFlowofAvianInfluenzaVirus(AIV)RealphylogenyofAIVinNorthAmerica(PB2)TheoreticalphylogenyassumingalmostnogeneflowPacificflywayCentralflywayMississippiflywayAtlanticflywayAIVgeneflowLametal.Ecol.Lett.(2012)GeneFlowofAvianInfluenzaVirus(AIV)Virusmovementinsidethebody/orgranofapatientSalemi,etal.J.Virol.(2005)FrontallobeTemporallobeSpinalcordOccipital

lobeMeningesIliaclymphnodeSeminalvesiclesBrainLymphoidMaximumlikelihoodtreeofHIV-1envsequencesisolatedfromdifferentbrainandlymphoidtissuesatdifferenttimepointsVirusmovementinsidethebody/orgranofapatient追蹤HIV-1B亞型病毒株在歐洲的流行：使用系統(tǒng)進化發(fā)生地理學方法研究對象：16個歐洲國家和以色列研究方法：用系統(tǒng)進化發(fā)生地理學方法，推斷HIV-1B亞型在個國家的遷移史研究結果：歐洲大多數(shù)國家，HIV-1B亞型病毒是多途