附件2登革熱實(shí)驗室檢測指南一、目的（一）及時發(fā)現(xiàn)、診斷病例。（二)及時了解伊蚊媒介攜帶登革病毒狀況。（三）病毒分型和溯源.（四)為登革熱流行趨勢的預(yù)測、預(yù)警和制定防治對策、措施提供科學(xué)依據(jù).二、檢測對象（一)疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)WS216-2008）。（二)伊蚊成蚊和幼蟲。三、樣本采集、保存和運(yùn)輸（一）臨床標(biāo)本采集2份,保存于1室檢測，1份用于上級預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核(1,1）.1.登革熱臨床診斷病例及疑似病例，每次采集血液標(biāo)本5mL。2。登革熱臨床診斷和疑似的住院病例（包括初篩陰性），1天各一份。3.疫點(diǎn)首發(fā)病例，必要時應(yīng)采集第二份血標(biāo)本，距第一份血樣采集日期間隔在7天以上。（二）蚊媒標(biāo)本采集疫點(diǎn)內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲,分類鑒定后，填寫媒介標(biāo)本采集信息表，按照采集地點(diǎn)分裝，每管10-20只。（三)標(biāo)本保存、運(yùn)送標(biāo)本應(yīng)—70℃以下保存，血液標(biāo)本可-20℃以下保存，但不超過1周.標(biāo)本運(yùn)送時采用低溫冷藏運(yùn)輸,避免凍融，樣本運(yùn)輸應(yīng)遵守國家相關(guān)生物安全規(guī)定.四、檢測內(nèi)容（一)實(shí)驗室檢測登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/或縣（市)疾控機(jī)構(gòu)采集病例血清，檢測登革病毒抗原、核酸或抗體，檢測流程參見圖1。（二）復(fù)核檢測送市或省級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的臨床標(biāo)本，抽樣30%首發(fā)病例需采用病原學(xué)和/或雙份標(biāo)本血清學(xué)方法復(fù)核檢測，暴發(fā)疫情復(fù)核檢測5例,5例者應(yīng)全部檢測，病毒核酸陽性標(biāo)本應(yīng)分型檢測。PCR方法進(jìn)行分型檢測，陽性者分離病毒,E成序列分析.3。每次暴發(fā)疫情應(yīng)開展病毒全基因組序列分析。4。實(shí)驗室檢測陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對恢復(fù)期血清進(jìn)行IgM、IgG抗體和/或中和抗體檢測。（三)媒介標(biāo)本檢測核酸檢測捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲,進(jìn)行核酸分型檢測,E成序列分析。2。病毒分離分離、基因組序列分析。圖1登革熱疑似病例實(shí)驗室檢測流程五、實(shí)驗室檢測方法（一)臨床標(biāo)本檢測1、病原學(xué)檢測病原學(xué)檢測主要適用于急性期血液標(biāo)本。(1）抗原檢測：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本NS1抗原檢出率高.標(biāo)本中檢出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場快速檢測，可用于早期診斷（附件2,3）.核酸檢測:6天內(nèi)血液標(biāo)本病毒核酸檢出率高.在病人血清（4）。病毒分離:5天內(nèi)血液標(biāo)本病毒分離率較高.將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞(C6/36）或哺乳動物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)（5），血清學(xué)檢測5天以后血液樣本,其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。血清特異性IgM抗體：采用ELISAIgM能確診（6）.(2）IgG抗體:ELISA、免疫熒光(IFA）、免疫層析等方法檢測。患者恢復(fù)期血清IgG4診（7，8）。(3）中和抗體:采用空斑減少中和實(shí)驗、微量中和實(shí)驗等方法檢測，可用于分型.4(二)媒介標(biāo)本檢測標(biāo)本處理10~20理（9）。病毒核酸檢測RT-PCR的方法進(jìn)行登革病毒核酸檢測（3.病毒分離病毒核酸陽性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離（見附件5）.六、實(shí)驗室質(zhì)量控制（一)標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送采集的標(biāo)本要做好標(biāo)識，并記錄標(biāo)本的基本信息和流行病學(xué)信息,按本指南要求采集、保存和運(yùn)送。(二）實(shí)驗室檢測根據(jù)發(fā)病時間,按本指南要求選擇不同的檢測方法。核酸檢測要防止各種污染，按操作規(guī)范設(shè)立相應(yīng)對照。應(yīng)對檢測試劑開展質(zhì)控評價.(三）考核，及時發(fā)現(xiàn)問題。七、結(jié)果的報告和反饋24檢單位.1月將上一年登革熱實(shí)驗室病原學(xué)（包括核酸檢測、病毒分離、序列測定）監(jiān)測結(jié)果，報國家疾病預(yù)防控制中心（denguetest＠126.com.八、生物安全定要求，做好生物安全工作。附件：1.血液標(biāo)本采集.血清分離.運(yùn)送。保存標(biāo)準(zhǔn)化操作程序2NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序3NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序4。RT—PCR法分型檢測登革病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序5。細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒IgMELISA法（MacELISA）IgM抗體IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序附表:疑似登革熱病人檢材送檢一覽表1

血液標(biāo)本采集、血清分離、運(yùn)送、保存標(biāo)準(zhǔn)化操作程序正確采集血液標(biāo)本、分離血清、運(yùn)送和保存。范圍適用于有資質(zhì)的人采集登革熱患者或疑似患者血液標(biāo)本、分離血清、編號、分裝、保存和運(yùn)送。操作步驟3。1采血3.1.17030秒鐘以上.312然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚3010%60秒)1.5—2cm直徑畫圈進(jìn)行消毒.3。1。3用70％酒精脫碘。3.1.4嚴(yán)格執(zhí)行三步消毒后(注意對碘過敏的患者,70%酒精消毒，消60秒鐘)5mL3。2分離血清3.2.1輕緩顛倒采血管數(shù)次，使血液與促凝劑混勻后靜置，待血塊完全凝固（放置時間過長會造成溶血，避免留置過夜).3。2。23000rpm離心，53管，應(yīng)避免吸取血細(xì)胞。3。2。3標(biāo)記。用標(biāo)簽紙或持久性標(biāo)記筆在凍存管的側(cè)壁標(biāo)記標(biāo)本編號,2—8或運(yùn)送保存。在編碼規(guī)則為“地區(qū)拼音首字母(2位）月位）—3位2013812份血標(biāo)本的血清編號為JH1308—012，凍存管頂端分別標(biāo)記012—1，012-2和012—3。3.3運(yùn)送保存。3。3.1如果24小時能夠完成初篩檢測，并將標(biāo)本運(yùn)送至上級單位，運(yùn)送前應(yīng)將標(biāo)本保存于2—8℃冰箱，運(yùn)送時采用低溫冷藏運(yùn)輸。3.3。2如果不能及時運(yùn)送，運(yùn)送前應(yīng)將標(biāo)本保存于—20℃冰箱，運(yùn)送時采用干冰或低溫冷藏運(yùn)輸。333樣本長期保存應(yīng)記錄剩余血清量和盒中位置,保存于-70℃以下冰箱。3。3。4所有樣本運(yùn)輸和保存應(yīng)遵守國家相關(guān)生物安全規(guī)定。注意事項任何情況下均不應(yīng)試圖將針頭重新蓋帽。立即用肥皂和水洗手。立即止血.并按醫(yī)療救護(hù)規(guī)程進(jìn)行評估和救護(hù).附件2酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的酶聯(lián)免疫法檢測患者血清中登革病毒NS1抗原.適用范圍適用于患者血清或血漿中登革熱病毒NS1抗原的快速檢測。實(shí)驗前準(zhǔn)備3。1核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等.3。2檢測前應(yīng)將待測樣品置于2-8℃冰箱或冰上。檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。檢測儀器設(shè)備和材料450nm盒（酶聯(lián)免疫法（萬泰公司）檢測的環(huán)境條件生物安全二級實(shí)驗室（BSL-2）中進(jìn)行，滅活后樣本在生物安全一級實(shí)驗室（BSL—1）內(nèi)進(jìn)行。操作步驟7130蕩混勻。7.2配液:將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋.7。3編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照3孔,陽性對照2孔和空白對照1孔。7。450μ空白孔除外。7.550μ7。6溫育：用封板膜封板后,置37℃溫育60分鐘。7。750μ7。8溫育:用封板膜封板后，置37℃溫育30分鐘。7.9洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干.7。10顯色:A、B50μL,輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。7.1150μL,10450nm（450nm/600—650nm檢測A值。結(jié)果判定臨界值計算:臨界值=010+A（A值低于0。05者以0。05計算）.A≤0。1（1A0。10.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗。陽性對照正常值范圍：A≥0。8。A值≥臨界值者為登革病毒抗原陽性。A值＜臨界值者為登革病毒抗原陰性。意義結(jié)合臨床信息,陽性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除登革病毒感染的可能。附件3膠體金免疫層析法檢測登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的檢測患者血液中登革病毒抗原.適用范圍檢測患者血清、血漿、全血中登革熱病毒抗原水平,主要用于登革病毒感染的輔助診斷.實(shí)驗前準(zhǔn)備3。1核對被檢樣品（血清或血漿)患者的姓名、編號及檢測項目等.3。2檢測前應(yīng)將待測樣品置于2-8℃冰箱或冰上。檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、登革熱病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）檢測的環(huán)境條件生物安全二級實(shí)驗室（BSL—2)中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級實(shí)驗室（BSL-1）內(nèi)進(jìn)行。檢測步驟將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫.72,平放于水平桌面上。在檢測卡上標(biāo)記病人的樣本號。1滴（30—45μ血清或血漿標(biāo)本，加于檢測卡/1滴(30-45μL）稀釋液，保證操作過程中沒有氣泡產(chǎn)生.（30秒鐘,沒有看到樣本移動，可能是由于樣本太黏稠1滴樣本稀釋液。7。520—25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果,并將結(jié)果拍照.結(jié)果解釋8。1陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C出現(xiàn)肉眼可見條帶。CT均出現(xiàn)肉眼可見條帶。無效結(jié)果:C陰性樣本對該批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制：8。4.1新檢驗員使用本產(chǎn)品。8.4。2使用新批號產(chǎn)品。8.4。3試劑卡儲存溫度在2—30℃以外.8.4.4測試區(qū)溫度在2—30℃以外。意義性結(jié)果說明沒有檢測到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染.附件4RT-PCR法分型檢測登革病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的登革熱患者和/或媒介伊蚊標(biāo)本中病毒核酸的提取及PCR分型檢測。適用范圍適用于患者血標(biāo)本及其傳播媒介標(biāo)本的檢測。檢測的環(huán)境條件在標(biāo)本中提取登革病毒RNA的實(shí)驗要求在BSL—2實(shí)驗室操作,PCR分型檢測在專門PCR室或區(qū)域操作。實(shí)驗步驟4。1實(shí)驗準(zhǔn)備4.1.1在標(biāo)本中提取登革病毒RNA要求在BSL-2實(shí)驗室，PCR分型在綜合實(shí)驗室獨(dú)立區(qū)域或?qū)ｉTPCR室操作。。2進(jìn)入實(shí)驗場所之前,要事先準(zhǔn)備好所需試劑，樣品.看前一位實(shí)驗者是否已經(jīng)清場.RNA的提取4。2.1使用QIAampViralRNAMini試劑盒提取血清標(biāo)本中病毒RNA。1吸取560μlRNA的AVL緩沖液至1.5ml的離心管中.4。2。1。2向上述的液體中加入140μl樣品，脈沖渦旋式混勻15秒，室溫孵育10分鐘，簡單離心使離心管頂端液體落到底部.4.2。1.3在樣品中加入560μl 96－100%的乙醇,混勻15秒，再簡單離心。4。2.1.4小心將630μl液體加入未浸濕的QIAamp小柱中,蓋好蓋，離心8000rpm/min1min，棄去收集管,將柱子置于一新的2ml收集管上。4。2。1.5打開QIAamp小柱的蓋子，重復(fù)步驟6，直至樣品全部離心。4。2。1。6打開蓋子，向柱中加入500μlAW1緩沖液,蓋好蓋，離心8000rpm/min1min，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。4。2.1.7打開蓋子,加入500μlAW214，000rpm/min3min。4。2。1。將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。h.1.5ml50μl8000rpm/min1min。4。2。2RNeasyMiniKit提取媒介組織標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒RNA4.22.1KitRLT液，根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝適量RLTβ-巰基乙醇，分裝至相應(yīng)的預(yù)先標(biāo)記好的微量離心管中，每管600μ。150μl組織研磨混懸液分別加入相應(yīng)的RLT4.2。2.3750μl70％的乙醇，充分混勻。Kit2中的混合液750μl加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。2中,12000rpm15s，棄離心液；4。2.2.6700μlWashBufferRW1液，12000rpm15s。4.22.7QIAGENRNeasyMiniKit2mL500μlWashBufferRPE液42.2.8500μlWashBufferRPE液，13000~14000rpm，離心2min。29RNA15mLeppendorf管上,30～50μl的RNase—freeWater1～3min.42210以下保存。RT-PCR4。3。1引物：引物序列見下表引物序列片段大小D15’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAAC511D2CG—3’5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGT511TS1TC—3'5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG—3’482(D1+TS1)TS25'-CGCCACAAGGGCCATGAACAG—3'119TS35'—TAACATCATCATGAGACAGAGC—3’（D1+TS2）290(D1+TS3)TS45'—CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’392(D1+TS4）4.3。2PCR擴(kuò)增PCR,正向引物D1D2PCRPCR擴(kuò)增。推薦反應(yīng)條件為94℃預(yù)2min,9430秒,553072140循7210分鐘。第二輪分型PCR擴(kuò)增體系配置采用正向引物D1與反向引物TS1TS2和TS4。推薦反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性2min,然后94℃變性30秒，55℃退火30秒,72℃延伸1分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘.4.3。31.5%濃度瓊脂糖電泳分析，確定病毒型別.4。3。4結(jié)果判讀陽性:型:500bpDNA片段.100bpDNA片段.300bpDNA片段。400bpDNA片段。4。3.4.2陰性：無特異性核酸片段擴(kuò)增.。5意義陽性結(jié)果可以確診登革病毒感染，可用于登革熱早期診斷。RT—PCR法分型檢測登革病毒核酸4。4.1引物與探針引物探針 序列 熒光標(biāo)記DEN—18973FDEN-19084CDEN-18998probeDEN—21443FDEN-21518CDEN-21469probeDEN—3740FDEN-3813CDEN-3762probeDEN-4904FDEN-4992CDEN—4960probe

CAAAAGGAAGTCGTGCAATACTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACCCATGTGGTTGGGAGCACGCCAGGTTATGGCACTGTCACGATCCATCTGCAGCAACACCATCTCCTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAAGGACTGGACACACGCACTCACATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCTACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGTTGTCCTAATGATGCTGGTCGTCCACCTGAGACTCCTTCCATTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG

FAM/BHQ—1HEX/BHQ-1TesasRed/BHQ—2Cy5/BHQ—34.4。2實(shí)時熒光定量RT—PCR擴(kuò)增實(shí)時熒光定量RT—PCR擴(kuò)增反應(yīng)配置體系，參考如下:RNA5μl0.5μl,12.5μl,0.5μl(4對,8條），探針各0。25μl,25μl。60℃30s404。4。3結(jié)果判斷PCR3～15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，以本底信號10的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），Ct<35熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標(biāo)本，可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測陽性.4.4。4意義RNA測登革熱患者血清或蚊媒標(biāo)本中的登革病毒。附件5細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒目的分離登革病毒。適用范圍5日內(nèi)的登革患者血標(biāo)本.經(jīng)研磨處理的媒介蚊標(biāo)本（11）。實(shí)驗前準(zhǔn)備項目等。蚊媒標(biāo)本應(yīng)核對標(biāo)本種類、編號、性狀等.C6/36，BHK21，VERO等2—8℃冰箱或置于冰上5、操作步驟5.110μL20μLHanks1：100.1mL或0.2mL備用。5。2將在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用Hank’s液洗滌2遍。5.3C6/36281371小時,1mL,C6/3628℃培養(yǎng)，BHK21細(xì)37℃培養(yǎng)。54第二天開始觀察細(xì)胞病變情況.如果沒有細(xì)胞病變,3代(0。1ml）接種細(xì)胞傳代。5。4免疫熒光法鑒定登革病毒5。4.1細(xì)胞抗原片的制備：出現(xiàn)“++”細(xì)胞病變的細(xì)胞倒去維持液（若盲傳無細(xì)胞病變出現(xiàn)，仍然按此方法制備），pH7。2PBS2PBS用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下,轉(zhuǎn)/5分鐘，棄去PBS02mlPBS10分鐘,PBS21次,吹干備用；54222孔（加PBS），3730分鐘；5.4.3取出,PBS31次,5。4.4熒光顯微鏡觀察結(jié)果。5.5其他檢測病毒抗原或核酸鑒定登革病毒參見附件2、4、5.5。6結(jié)果判斷：免疫檢測有特異性黃綠色顆粒狀熒光,檢測出病毒NS1抗原或病毒核酸可確定病毒分離成功。5。7意義：從病人血清或蚊媒中分離出登革病毒，可確診登革感染。6廢棄物處理所有實(shí)驗用品都應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)傳染病處理方法高壓處理。6

IgM捕捉ELISA法(MacELISA）檢測登革熱IgM抗體檢測出登革病毒特異性IgM抗體。適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性IgM抗體的快速檢測。樣品接收和準(zhǔn)備3。1核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.22-8℃冰箱或置于冰上。檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中病毒特異性IgM抗體檢測儀器設(shè)備和材料450nmIgM試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧?抗原:C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原陰性抗原:C6/36細(xì)胞為陰性抗原對照。IgM（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；IgM陽性、陰性對照血清；5。5緩沖液：洗滌液：pH7.4PBS－T(0.05％吐溫－20);稀釋液：pH7.4PBS（5％牛血清；封閉液：pH。6碳酸緩沖液(％牛血清白蛋白；5。6顯色液：A/B液5。7終止液:4NH2SO4檢測的環(huán)境條件生物安全二級實(shí)驗室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級實(shí)驗室（BSL—1)內(nèi)進(jìn)行.檢測原理μIgM抗體，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的病毒抗原物,IgM適用于出血熱的早期特異性診斷及其它實(shí)驗性研究.檢測步驟用稀釋液按效價稀釋抗人μ鏈單克隆抗體,100μl/孔,加蓋，4℃過夜；棄去抗人μ鏈,3次,2小時；3次,甩干。8。41：1024倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板4μl/372小時;8.534DV抗原對照,100μl/孔，4℃過夜；8。63次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體,4l/孔,372小時；8。7棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴,37℃,避光3～5分鐘；8.8加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。結(jié)果判斷（1)目測方法：陽性對照孔呈明顯藍(lán)色,陰性對照孔呈無色,(TMIgM抗體陽性,反之陰性.酶聯(lián)免疫檢測儀檢測:450nm(TMB）OD值/ODP/N≥2。1，對照成立;ODOD比值≥2OD005005005按實(shí)際數(shù)值計算）意義陽性結(jié)果,提示患者新近登革病毒感染，用于登革熱早期臨床診斷.附件7酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的檢測出登革病毒特異性IgG抗體。適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性IgG抗體的快速檢測。實(shí)驗前準(zhǔn)備（1）核對被檢樣品（血清或血漿)患者的姓名、編號及檢測項目等.（2)待測樣品在檢測前應(yīng)放置于2—8℃冰箱或置于冰上。檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中病毒特異性IgG抗體檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgG抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希嚎乖篊6/36C6/36細(xì)胞為陰性抗原對照。5。2IgG抗體；5。3緩沖液：包被液：pH9。6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7。4PBS－T（0。05％吐溫－20)；5.4顯色液：A/B液5。5終止液：4NH2SO45。6酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。檢測的環(huán)境條件生物安全二級實(shí)驗室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級實(shí)驗室（BSL—1)內(nèi)進(jìn)行.檢測步驟7。1用包被液按工作濃度稀釋抗原，100μl/孔，4℃過夜；7。2PBS—T3～5次，甩干；7。3將待檢血清用稀釋液從1:100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100μl/孔，同時設(shè)陰、陽性對照，37℃水浴1小時;7.4棄去血清，用洗滌液洗滌5～6次；7。5加酶結(jié)合物,用稀釋液按工作濃度稀釋，100μl/孔，37℃水浴1小時;7。6棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干;7。7加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；7.8加終止液于每反應(yīng)孔,100l/孔.結(jié)果判斷450nm（TMB）OD值/ODP/N≥2.1，對ODOD比值≥2.(OD0050050.05按實(shí)際數(shù)值計算）意義陽性結(jié)果，表明曾受到DV感染；恢復(fù)期血清抗體陽轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高則可確診。附件8免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的免疫熒光法（IFA)檢測抗登革病毒IgG抗體。適用范圍適用于人血清或血漿中登革熱病毒特異性IgG抗體的快速檢測。實(shí)驗前準(zhǔn)備(1）核對被檢樣品（血清或血漿