基因工程復習一一、基因工程的基本內(nèi)容

基因工程，確切地講就是重組DNA技術，指在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成雜合DNA或稱嵌合DNA分子，然后將其導入特定的宿主細胞，得到大量擴增和表達，使宿主細胞獲得新的遺傳特性，產(chǎn)生新的基因產(chǎn)物?；蚬こ蹋蚍Q遺傳工程，興起于20世紀70年代。人類實現(xiàn)對基因進行自如地操作、轉移和改造的理想，是在核酸限制性內(nèi)切酶、載體質(zhì)粒、連接酶和其它修飾酶被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)以后。在此基礎上，核酸和蛋白質(zhì)序列測定、基因體外快速突變、DNA的人工合成等，則使得基因工程逐漸成熟和發(fā)展。操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因ＤＮＡ分子水平剪切拼接導入表達人類需要的基因產(chǎn)物基因拼接技術或DNA重組技術實質(zhì)：基因重組基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：蘇云金芽孢桿菌(有抗蟲特性)普通棉花(無抗蟲特性)抗蟲基因與運載體DNA拼接導入棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)提取關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取。關鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接。關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉細胞。

通過觀察抗蟲棉的培育過程，你認為關鍵的步驟是什么？關鍵步驟一的工具：基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶。關鍵步驟二的工具：基因的針線——DNA連接酶。關鍵步驟三的工具：基因的運輸工具——運載體。

1、作用——限制性核酸內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并在使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷酸之間的連接ATGGCATCTTCGAA

大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，例如，EcoRΙ、SmaΙ，也有少數(shù)有4、5或8個核苷酸組成。GAATTC

CTTAAG

中軸線CTTAA

G

AATTCG

大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，SmaI識別CCCGGG序列:

CCCGGG

GGGCCC

CCCGGG

GGGCCC

黏性末端平末端GAATTCGCTTAAAATTCG限制酶切割ＤＮＡ分子示意圖CTTAAG思考

要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？兩個切口，四個黏性末端。

2、DNA連接酶——“分子縫合針”作用——把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來。G

AATTCCTTAA

G

即脫氧核糖、磷酸基之間的連接

GP

AP自己動手吧！

限制酶切割后有兩種不同的結果，一種產(chǎn)生黏性末端，一種產(chǎn)生平末端。那么恢復它們的連接時，所用DNA連接酶是否一樣呢？E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（在“梯子”的扶手處），不是氫鍵（在“梯子”的踏板處）。結果：兩個相同的黏性末端的連接。

思考（１）用DNA連接酶連接兩個相同的黏性末端要連接幾個磷酸二酯鍵？（２）用限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵？２個４個３、基因的運輸工具——運載體作用：具備的條件種類：將外源基因送入受體細胞。能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定地保存具有多個限制酶切點具有某些標記基因質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。使用運載體的目的：用它作為運載工具，將目的基因送到宿主細胞中去。思考：1、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2）載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3）載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。（4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。（5）載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。2、根據(jù)你所掌握的知識，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。3、DNA連接酶連接的是什么部位？DNA連接酶是將一段DNA片段3′端的羥基與另一DNA片段5′端磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵，而不是連接互補堿基之間的氫鍵。4、DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？答：不是一回事。基因工程中所用的連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒是基因工程中最常用的運載體；2、存在于許多細菌及酵母菌等生物中；3、細菌DNA外能自主復制的小型環(huán)狀DNA分子；4、最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；5、質(zhì)粒的存在對宿主細胞無影響；6、質(zhì)粒的復制只能在宿主細胞內(nèi)完成。（１）質(zhì)粒上會存在某些標記基因，標記基因有什么用途？（２）要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性內(nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理？思考感受高考已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指。如果在該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段。現(xiàn)有多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是 (全國理綜4)

A．3B．4C．9D．12C二、基因工程的基本操作步驟1、獲得目的基因2、形成重組DNA分子3、將重組DNA分子導入受體細胞4、篩選含有目的基因的受體細胞5、目的基因的表達一、獲得目的基因從基因文庫中尋找聚合酶鏈式反應（PCR）擴增化學合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因從基因文庫中獲取利用PCR技術擴增利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法2構建載體形成重組DNA分子方法：同種限制酶分別切割載體和目的基因，再用DNA連接酶把兩者連接。一原核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游調(diào)控遺傳信息的表達(調(diào)控序列)編碼蛋白質(zhì)(編碼序列)一原核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點RNA聚合酶是一種蛋白質(zhì)，能識別并與調(diào)控序列中的結合位點結合，能催化DNA轉錄為RNA一原核細胞的基因結構與RNA聚合酶結合位點RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGC一原核細胞的基因結構與RNA聚合酶結合位點AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG一原核細胞的基因結構與RNA聚合酶結合位點AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG二真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)下游調(diào)控遺傳信息的表達(調(diào)控序列)外顯子(能編碼蛋白質(zhì))內(nèi)含子(不能編碼蛋白質(zhì))將重組DNA分子導入受體細胞導入植物細胞補充歸納導入方法（重組DNA分子導入農(nóng)桿菌，再讓農(nóng)桿菌感染植物細胞）將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法導入動物的方法將目的基因導入動物細胞顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）導入微生物將目的基因導入微生物細胞4檢測和鑒定Ca2＋處理受體細胞成為感受態(tài)細胞，再進行混合。篩選含有目的基因的受體細胞

目的基因的表達檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定分別提取什么進行檢測DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測SARS病毒等）abcd①檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。②檢測是否轉錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進行抗原－抗體雜交，看是否有雜交帶。④還可以進行個體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：①DNA分子雜交技術首先提取受體細胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標記的DNA探針雜交；②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達出的蛋白質(zhì)注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應的抗體，并提取出而來的。32．（8分）將動物致病菌的抗原基因導入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關的圖和表。(08江蘇)請根據(jù)以上圖表回答下列問題。（1）在采用常規(guī)PCR方法擴增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點是耐高溫（2）PCR過程中退火（復性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設定。表1為根據(jù)模板設計的兩對引物序列，圖2為引物對與模板結合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？__________。引物對B（3）圖1步驟③所用的DNA