3.2月季的花藥培養(yǎng)知識回顧：練習：小麥高桿（D）對矮桿（d）為顯性，抗銹病（T）對不抗銹?。╰）為顯性，現(xiàn)有高桿抗銹病和矮桿不抗病的兩種純合體，如何快速獲得矮桿抗銹病的純種？P：DdTt，高稈抗銹病DT，Dt,dT,dtddTT矮稈抗銹病↓雜交花藥離體培養(yǎng)DT，Dt,dT,dt↓秋水仙素處理高桿抗銹?。―DTT）×矮稈不抗銹?。╠dtt）

F1：的基因型和表現(xiàn)型：各種配子的種類：符合要求的單倍體的基因型：

良種的基因型表現(xiàn)型↓花藥離體培養(yǎng)單倍體植株（N）秋水仙素處理植株（2N）1.明顯縮短育種年限2.后代植株都為純合子正常植株（2N）單倍體育種的過程是什么？特點：一、基礎知識（一）被子植物的花粉發(fā)育1、被子植物的花的結構：花托花萼花瓣雄蕊花藥花絲雌蕊柱頭花柱子房被子植物子房的結構胚珠的結構卵細胞極核子房壁珠被珠孔植物的雙受精作用：花雄蕊雌蕊花藥花粉粒精子精子子房胚珠胚囊子房壁珠被卵細胞兩個極核受精卵受精極核胚胚乳種皮種子果皮果實有絲分裂有絲分裂1n1n2n1n3n2n2n2n2n胚是一個新個體的幼體（胚芽胚根子葉胚軸）小孢子母細胞小孢子花粉囊花藥花粉粒（雙核期）成熟花粉2、被子植物花粉的發(fā)育花粉是花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的。因此，花粉是單倍體的生殖細胞。①經(jīng)歷時期：四分體時期、單核期、雙核期小孢子四分體單核雙核②花粉粒的形成1花粉母細胞4個小孢子

(小孢子四分體)減數(shù)分裂有絲分裂1個花粉管細胞核1個生殖細胞核有絲分裂2個精子單核居中期單核靠邊期雙核期1個營養(yǎng)細胞1個生殖細胞(2n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)花粉?；ǚ哿ｎ愋鸵粋€成熟的花粉粒即為雄配子體，有兩種情況：成熟的花粉粒中，只含花粉管細

胞核和生殖細胞核。（精子在花粉管

中形成）。有些植物的花粉，在成熟前，生

殖細胞進行一次有絲分裂，形成兩個

精子，這樣的花粉在成熟時，含有一

個營養(yǎng)核和兩個精子。二核花粉粒:三核花粉粒:被子植物的雌蕊營養(yǎng)細胞在花粉萌發(fā)過程中的作用：控制花粉的萌發(fā)并提供營養(yǎng)例1：關于被子植物花粉發(fā)育的說法，不正確的是（）A、花粉粒是在花藥中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接減數(shù)分裂的結果C、被子植物的花粉的發(fā)育要經(jīng)歷四分體時期、單核期、雙核期等階段D、花粉粒在發(fā)育過程中，核先位于細胞一側，再移到細胞中央BD（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑①②移栽花藥中的花粉胚狀體脫分化愈傷組織花藥中的花粉脫分化分化

叢芽再分化

叢芽誘導生根體細胞胚（胚狀體）：在組織培養(yǎng)過程中，某些細胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚非常相似的結構，發(fā)育過程亦與合子胚類似。體細胞體細胞胚類似合子發(fā)育成的胚的結構（具有胚根、胚芽、胚軸等結構）植物組織培養(yǎng)過程中單倍體性細胞花粉胚知識拓展①胚狀體②胚狀體的結構及其發(fā)育過程與種子相似1、形成原因培養(yǎng)基中的激素種類及濃度配比2、植株的特點：單倍體植株，植株弱小，高度不育。思考：（1）為什么愈傷組織和胚狀體到叢芽分別稱為分化和再分化？胚狀體就像種子，有胚芽、胚軸、胚根等結構。胚狀體到叢芽就是由原始的分化狀態(tài)繼續(xù)生長和分化完成的。而愈傷組織形成叢芽的過程是從脫分化狀態(tài)進入再分化形成叢芽的過程。（2）花粉植株弱小，高度不育，是否就沒有利用價值？用于單倍體育種技術，可明顯縮短育種周期，培育純合新品種。

煙草花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)育途徑：愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥愈傷組織發(fā)育途徑：（三）影響花藥培養(yǎng)的因素1、材料的選擇從花期看：月季的初花期從花粉發(fā)育時期看：單核期從花蕾看：完全未開放的(可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒)選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期之后的花藥接種，花瓣已有些松動，又給材料的消毒帶來困難，且難以挑選到單核期的花藥。其它時期選擇的缺點:2、培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基可能因植物的不同而有所變化。小麥為N6培養(yǎng)基，馬鈴薯、月季為MS培養(yǎng)基，油菜為B5培養(yǎng)基。3、其他因素親本植株的生長條件、材料的低溫預處理以及接種的密度等對誘導成功都有一定的影響思考：為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。二、實驗操作（一）材料的選取選擇花藥時一般通過鏡檢確定花粉發(fā)育時期，此時需要對花粉細胞核進行染色。②某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色。①最常用的方法有醋酸洋紅法(將染色體染成紅色)1、方法①醋酸洋紅法染色機理醋酸洋紅為堿性染色劑，而花粉細胞內(nèi)有染色體，染色體主要成分是DNA和蛋白質(zhì),易被堿性染料著色染成紅色

。將體積分數(shù)45％的醋酸100ml煮沸，緩緩加入1g洋紅，再加熱回流8h，冷卻至50℃，過濾即可。②醋酸洋紅的配置2、醋酸洋紅法將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分數(shù)1％的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查。③染色操作3、焙花青—鉻釩法將無水酒精與冰醋酸按體積比為3：1的比例混勻①卡諾氏固定液的配制方法

花藥應該在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青—鉻釩溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查。這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色。將5g鉻明礬[K2SO4Cr2(SO4)·24H2O]加入90ml蒸餾水中，溶解后加入0.1g焙花青，混勻并加熱至沸騰，煮沸5分鐘后冷卻至室溫，過濾，加蒸餾水定容至100ml。②焙花青—鉻釩溶液的配制方法③染色操作（二）材料的消毒花蕾（70％酒精）大約30s（無菌水）清洗（無菌吸水紙）吸干

水分（1％氯化汞溶液）2～4min（無菌水）沖洗說明：用于培養(yǎng)的花藥，實際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。思考：月季花蕾的消毒與菊花外植體的消毒相比較，二者有何不同？在酒精消毒前，花藥不需要預先用流水沖洗、洗衣粉洗滌和軟刷刷洗。（三）接種和培養(yǎng)在無菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥②要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。

立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個。1、剝?nèi)』ㄋ帰傥饟p傷花藥，否則接種后容易從受傷部位產(chǎn)生愈傷組織。2、接種注意：①培養(yǎng)條件：溫度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培養(yǎng)②培養(yǎng)：一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。長出愈傷組織則將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。③注意：如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。

在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營養(yǎng)細胞核和生殖細胞核融合造成的）。4、鑒定和篩選三、結果分析與評價1、選材是否恰當2、無菌技術是否過關3、接種是否成功選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關鍵。如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要