比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法蛋白質(zhì)的合成受時(shí)空等多種因素調(diào)控，在不同的組織細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成及表達(dá)的種類(lèi)和數(shù)量有很大的差異，即使在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，因不同時(shí)期、不同條件，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成也在不斷的變化，是動(dòng)態(tài)的過(guò)程第一部分：基本概念比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第一部分：基本概念蛋白質(zhì)組(Proteome)指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。比較蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組間差異蛋白的研究。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第一部分：基本概念生物學(xué)問(wèn)題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離比較蛋白質(zhì)組學(xué)基本技術(shù)路線Introduction蛋白質(zhì)的提取1蛋白質(zhì)的分離2蛋白質(zhì)樣品的分析3驗(yàn)證4第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法Introduction蛋白質(zhì)的提取1莢膜層細(xì)胞粘液層比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。樣品的分級(jí)處理可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。樣品制備對(duì)于獲得可靠、準(zhǔn)確的2D電泳結(jié)果至關(guān)重要Introduction比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法增加樣品溶解性的手段變性劑：通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過(guò)變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法—水浴加熱處理—TritonX-114相分離法提取膜蛋白—蛋白質(zhì)沉淀及透析除雜—真空冷凍干燥硫轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白質(zhì)的有效分離和提取雙向電泳分離膜蛋白比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法雙向電泳具體步驟蛋白預(yù)處理（裂解，水化）蛋白質(zhì)上樣緩沖液的配制：一定量的

蛋白質(zhì)樣品溶解在緩沖液含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%NP-40，2%IPG緩沖液，65mmol/LDTT，0.002%溴酚藍(lán)IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色及脫色凝膠成像及圖像分析比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法凝膠的圖像處理分析和差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取及膠內(nèi)酶切凝膠圖像的掃描圖像加工斑點(diǎn)檢測(cè)和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取膠內(nèi)酶切ImageMaster2dPlatinum圖像分析軟件可用于膠的圖像分析比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法Introduction比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的挖取及脫色、膠內(nèi)酶切元素硫基質(zhì)中膜蛋白2-DE圖譜亞鐵基質(zhì)中膜蛋白2-DE圖譜選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)脫色處理后用胰蛋白酶（Trypsin）進(jìn)行特異性酶切，最后進(jìn)行質(zhì)譜分析得到相關(guān)肽指紋圖譜比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法目前雙向電泳需解決的問(wèn)題樣品的制備及溶解膜蛋白疏水性強(qiáng)初步分離高豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白靈敏度及可重復(fù)性第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法N-端測(cè)序：得到的是序列。未知蛋白測(cè)序。稱(chēng)為ProteinSequencing。

生物質(zhì)譜分析

：返回的數(shù)據(jù)是分子量。可以和已知的蛋白（數(shù)據(jù)庫(kù)）比對(duì)，告訴你是什么蛋白。稱(chēng)為ProteinIdentificationbyMS。比較蛋白質(zhì)組學(xué)主流手段是生物質(zhì)譜分析

，價(jià)格便宜，分析速度快。比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法蛋白質(zhì)樣品的分析3比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法質(zhì)譜分析原理進(jìn)樣系統(tǒng)1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.色譜離子源1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離4.激光

質(zhì)量分析器1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時(shí)間4.四極桿

檢測(cè)器MALDI-TOF一級(jí)質(zhì)譜儀，二級(jí)質(zhì)譜，MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀，LC-MS/MS色譜質(zhì)譜連用比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法A.ferrooxidans胞外蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽指紋圖質(zhì)譜結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法軟件名稱(chēng)MascotSEQUESTX!Tandem軟件類(lèi)型商業(yè)軟件商業(yè)軟件免費(fèi)開(kāi)源軟件數(shù)據(jù)格式MGF、DTA、PKLRAW、DTADTA、PKL、MGF、mzXML注：在線檢索均為免費(fèi)蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索常用軟件常用的是Mascot比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以知道數(shù)據(jù)庫(kù)大小匹配的結(jié)果大于70分即成功鑒定(可靠性達(dá)到顯著水平)縱坐標(biāo)：匹配的蛋白數(shù)目陰影線：區(qū)分匹配結(jié)果可靠與不可靠的分界線橫坐標(biāo)：匹配的蛋白得分小紅柱：匹配的結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法ProtParam蛋白質(zhì)序列的物理-化學(xué)參數(shù)（氨基酸、原子組成，等電點(diǎn)，消光系數(shù)等）MultiIdent通過(guò)等電點(diǎn)、分子量、氨基酸組成、序列標(biāo)簽、肽指紋數(shù)據(jù)等識(shí)別蛋白AACompSim蛋白質(zhì)氨基酸組成與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析AACompIdent通過(guò)氨基酸組成識(shí)別蛋白質(zhì)

3DProteinDisplayandSequenceAnalysisforthePC(UIUC)蛋白質(zhì)三維構(gòu)象展示第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法驗(yàn)證4比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法1.蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即WesternBlot?

試劑準(zhǔn)備?

樣品制備?

含量測(cè)定?

SDS－PAGE電泳?

轉(zhuǎn)膜?

免疫反應(yīng)?

化學(xué)發(fā)光?

凝膠圖象分析第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法未知樣品的Ct值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-timeqPCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。RT-PCR結(jié)果比較蛋白質(zhì)組學(xué)及系統(tǒng)研究方法第二部分：比較蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究方法XANES光譜：對(duì)提取