全血基因組DNA提取地中海貧血基因檢測(cè)概述地中海貧血是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血。地中海貧血主要分為α-地中海貧血和β-地中海貧血。α-地中海貧血基因診斷操作流程β-地中海貧血基因診斷操作流程實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握離心柱法提取全血DNA的檢測(cè)方法2了解DNA濃度及純度的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理(離心柱法)獨(dú)特的緩沖液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，使蛋白與DNA分離,然后基因組DNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅膠膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅膠膜上洗脫。樣品準(zhǔn)備用含抗凝劑的采血管進(jìn)行采血，抗凝劑一般有EDTA和枸櫞酸鈉,肝素對(duì)酶反應(yīng)有可能起抑制作用,如沒有特殊要求一般不采用。加入抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個(gè)月；－70℃長(zhǎng)期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。設(shè)備和材料56℃水浴箱臺(tái)式高速離心機(jī)微量移液器(200μl,1000μl)1.5ml離心管,離心管架高壓槍頭及盒衛(wèi)生紙

試劑準(zhǔn)備

血液DNA提取試劑盒主要成分包括：

緩沖液GB緩沖液GD

漂洗液PW洗脫緩沖液TB

蛋白酶K無水乙醇（自備）其他材料：吸附柱CB3收集管1.5ml離心管實(shí)驗(yàn)步驟

每組做兩個(gè)標(biāo)本，先準(zhǔn)備兩個(gè)1.5ml離心管，編號(hào)Ⅰ

樣本裂解加20ul蛋白酶加200ul全血加200ulGB顛倒混勻56℃水浴10分鐘裂解后樣本實(shí)驗(yàn)步驟裂解后樣本沉淀核酸核酸吸附吸附柱放入收集管中，編號(hào)將上一步所有溶液和絮狀沉淀分別加入吸附柱中；13000rpm離心30sec倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中加200ul無水乙醇顛倒混勻注意:動(dòng)作輕柔實(shí)驗(yàn)步驟裂解后樣本.漂洗去雜向吸附柱中加入500ulGD,13000rpm離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm離心2min,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中柱子開蓋室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液沉淀核酸核酸吸附實(shí)驗(yàn)步驟裂解后樣本.漂洗去雜將吸附柱轉(zhuǎn)于干凈1.5ml離心管中;向吸附柱中間位置懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TB,于室溫放置2-5min;13000rpm離心2min,將溶液收集到離心管中,得到基因組DNA,棄去吸附柱編號(hào)保存沉淀核酸核酸吸附洗脫DNADNA檢測(cè)方法1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA分子大小及完整性紫外分光光度法鑒定DNA純度在260nm和280nm處測(cè)定DNA溶液的光吸收

OD260/OD280<1.7有蛋白的污染

OD260/OD280＝1.7～1.9純度很好

OD260/OD280>1.9有部分降解或有RNA污染

DNA濃度計(jì)算：紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量

OD260×50ng/ul（雙鏈DNA）×稀釋倍數(shù)DNA的保存提取的DNA作好標(biāo)記（標(biāo)注名稱，日期），交上來一起保存與冰箱-20℃。(短期可置于4℃，長(zhǎng)期于-70℃分裝保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融)注意事項(xiàng)使用時(shí)注意緩沖液GD和漂洗液PW中有無加入無水乙醇加入乙醇顛倒混勻后可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，動(dòng)作要輕柔。

用去蛋白液、漂洗液將膜上的核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心（或靜置）以去除殘留的液體及揮發(fā)乙醇成分。注意事項(xiàng)因?yàn)檫M(jìn)行的是PCR實(shí)驗(yàn)，所以要注意防止污染，開蓋要輕柔，防止液體