新疆人ACE，ApoE以及HLA-DRB基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽的關(guān)系,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文國(guó)際自然醫(yī)學(xué)會(huì)將新疆和田地區(qū)列為世界四大長(zhǎng)壽區(qū)之一，和田的長(zhǎng)壽人群稱之為自然長(zhǎng)壽人群。這一特殊人群為鑒定長(zhǎng)壽的相關(guān)基因、研究遺傳因素與長(zhǎng)壽的關(guān)系提供了一個(gè)理想的模型。研究表示清楚，除了健康生活方式和良好飲食習(xí)慣外，基因差異可能也是長(zhǎng)壽的影響因素之一。長(zhǎng)壽一般都無一導(dǎo)致大多數(shù)成年人死亡的主要疾病，例如心血管病、糖尿病、老年癡呆癥和癌癥等，這為我們尋找與長(zhǎng)壽相關(guān)基因提供了線索。本研究旨在討論新疆和田地區(qū)維吾爾族自然長(zhǎng)壽人群中ACE，ApoE以及HLA-DRB基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽的影響及互相關(guān)系，報(bào)告如下。對(duì)象與方式方法一、一般資料選擇新疆和田地區(qū)90歲的維吾爾族自然長(zhǎng)壽老人144例〔長(zhǎng)壽組〕，平均年齡95.53歲；選擇同地區(qū)，年齡60~70歲者69例為老年組，平均年齡為66.71歲；選擇以同一地區(qū)相互無血緣關(guān)系的已自然死亡的61~73歲者52例〔家族史中無壽命大于80歲者〕為對(duì)照組，平均年齡為67.60歲。年齡標(biāo)準(zhǔn)：人壽保險(xiǎn)公司提供百歲老人名單；逐村逐戶走訪，以四代人為基礎(chǔ)；按4次重大歷史事件〔1902年第1次鼠疫大流行事件；1912～1913年第2次鼠疫發(fā)生；1936年回民戰(zhàn)爭(zhēng)；1952年土地改革〕推定年齡，一般為6歲無記憶，12歲開場(chǎng)記憶，結(jié)婚年齡為15歲，能參軍打仗年齡為18歲。按此基本知識(shí)推斷再與1981年戶籍對(duì)照，誤差5歲；三查三對(duì)，不同的醫(yī)師進(jìn)行核對(duì)，不得出現(xiàn)矛盾；實(shí)際年齡參考公式=0.45(自報(bào)年齡)十50，實(shí)際年齡和自報(bào)年齡誤差不超過3歲。二、方式方法1.人基因組DNA提?。涸谥橥獾那疤嵯?，抽取靜脈血5ml，EDTA抗凝，低滲法破紅細(xì)胞，分離白細(xì)胞，基因組DNA采用酚/氯仿抽提的方式方法，純度為A260：A2801.8。2.PCR-SSP法擴(kuò)增HLA-DRB等位基因：PCR反響體系：在0.5mlEp管中依次參加下面試劑，dNTP1l，10緩沖液2.5l，DNA聚合酶(上海復(fù)華生物技術(shù)有限公司提供)0.5U，消毒去離子水16.5l，5引物及3引物各1l，模板DNA1l用石蠟油覆蓋，離心混勻，進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物10l電泳，于紫外燈下觀察。3.ACE基因多態(tài)性檢測(cè)：目的片斷擴(kuò)增參照Rigat的方式方法設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR反響終末體積為25l〔華而不實(shí)包括模板DNA1l，兩種引物分別為2pmol，MgCl2終濃度為2mmol/L，KCl終濃度為50mmol/L，Tris-HCl終濃度為10mmol/L〔pH8.0〕，Taq酶0.5U〕進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10l電泳，于紫外燈下觀察結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度確定其基因型別。4.單鏈構(gòu)象多態(tài)性〔SSCP〕分析：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性后電泳，硝酸銀染色分析電泳結(jié)果。將不同帶型標(biāo)本測(cè)序，確定變異堿基及其位置〔測(cè)序由北京華大中生科技公司完成〕。5.ApoE基因型檢測(cè)：以下為參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物〔由上海生工合成〕。PCR反響終末體積為25l，采用美國(guó)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物10l加10UHhaI內(nèi)切酶，37℃酶切3h。用8%聚丙烯酰胺凝膠于200V恒壓下垂直電泳3h，銀染，據(jù)獲得的6種酶切圖譜，判定apoE基因型。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各基因型頻率采用直接計(jì)數(shù)法。基因頻率=陽性基因數(shù)/樣本數(shù)2〔而HLA-DRB51,DR52,DR53陽性率=陽性基因數(shù)/樣本數(shù)〕。研究對(duì)象能否符合Hardy-Weinberg平衡用掊2檢驗(yàn)；HLA-DRB、ACE基因I/D多態(tài)性及ApoE基因分布，3組間基因型及等位基因頻率比擬用RC表掊2檢驗(yàn)。結(jié)果一、臨床特點(diǎn)本研究中患者均具體詢問病史、查體及行實(shí)驗(yàn)室檢查；測(cè)量身高、體重、血壓。實(shí)驗(yàn)室檢查包括測(cè)定血膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血糖水平。結(jié)果顯示，長(zhǎng)壽組與老年組體質(zhì)指數(shù)〔BMI〕間比擬其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕，長(zhǎng)壽組和老年組之間收縮壓和舒張壓的比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕；長(zhǎng)壽組與對(duì)照組間收縮壓的比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕；3組間低密度脂蛋白比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P均0.05〕，見表1。二、HLA基因型的頻率分布長(zhǎng)壽組HLA-DR1，DR6〔14〕基因頻率較對(duì)照組升高〔P＜0.05〕，與老年組比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；長(zhǎng)壽組HLA-DR9頻率較對(duì)照組降低〔P＜0.05〕，較老年組顯著降低〔P＜0.01〕；長(zhǎng)壽組HLA-DR51基因頻率較老年組降低〔P＜0.05〕，與對(duì)照組比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各型基因頻率3組間比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔表2〕。三、ACE基因型和等位基因頻率的分布長(zhǎng)壽組D/D基因型頻率較對(duì)照組顯著升高〔P0.01〕，與老年組比擬也有顯著升高〔P0.05〕；長(zhǎng)壽組D等位基因頻率亦顯著高于對(duì)照組〔P0.05〕，與老年組比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，3組間DI、Ⅱ基因型比擬其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。四、ApoE基因型和等位基因頻率的分布ApoE基因有6種不同的基因型。長(zhǎng)壽組ε3/3基因型頻率較老年組升高〔P0.05〕，與對(duì)照組比擬無明顯差異；長(zhǎng)壽組ε4/3基因型頻率較對(duì)照組明顯降低〔P0.001〕，較老年組也顯著降低〔P0.01〕；余基因型比擬其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大樣本群體調(diào)查發(fā)現(xiàn)ApoE基因型及等位基因頻率分布存在明顯種族差異。該研究結(jié)果顯示，ε3/3基因型也是維吾爾族的主要基因型，而ε3等位基因頻率介于白人和漢族人之間，表現(xiàn)出微弱種族差異性，見表4。討論人類白細(xì)胞抗原〔humanleukocyteantigen,HLA〕是人類基因組的一個(gè)重要組成部分，蘊(yùn)藏著豐富的遺傳信息，與機(jī)體免疫，疾病與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。本次研究中，長(zhǎng)壽組HLA-DR1，DR6〔14〕基因頻率高于對(duì)照組，而HLA-DR9，DR51基因頻率明顯低于老年組，考慮HLA-DR1、DR6〔14〕基因可能是長(zhǎng)壽有利基因，而HLA-DR9，DR51基因可能是長(zhǎng)壽的危險(xiǎn)因素。Takata等于20世紀(jì)90年代檢測(cè)了日本著名的長(zhǎng)壽宮82例百歲老人〔100~106歲〕、20例長(zhǎng)壽老人〔90~99歲〕，其對(duì)照組為159例同一地區(qū)的成年人，并各組分析了HLA基因頻率。結(jié)果為百歲老人組HLA-DRw9基因頻率為8.5％，長(zhǎng)壽組為5.0％，而對(duì)照組則為30.8％。在HLA-DR1出現(xiàn)頻率又有不同，百歲老人6％，長(zhǎng)壽老人10％，而對(duì)照組0.63％。故提出HLA是決定人類壽命基因之一。Henon等研究了336例百歲以上退伍老兵和102例90歲以上的隨機(jī)選自家庭的長(zhǎng)壽老人，得出HLA-DR11分子的保衛(wèi)效應(yīng)，充分地表現(xiàn)了免疫易感基因優(yōu)勢(shì)，有力地證明了HLA-DR11基因的長(zhǎng)壽效應(yīng)。Akisaka等報(bào)道HLA-DR9在日本沖繩百歲老人中的頻率很低，是長(zhǎng)壽的危險(xiǎn)因素，HLA-DR1則表現(xiàn)很高的頻率而被以為是有利因素。Lio等對(duì)撒丁島地區(qū)120例長(zhǎng)壽老人和86例當(dāng)?shù)貙?duì)照組進(jìn)行研究，未發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1各等位基因頻率間存在明顯差異。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶〔angiotensin-covertingen-zyme,ACE〕基因位于人染色體17q23區(qū)，在第16內(nèi)含子中含有287bp的插入/缺失多態(tài)性。當(dāng)前以為ACE基因插入/缺失〔I/D〕多態(tài)性與心腦血管疾病有密切關(guān)系，而研究證實(shí)ACE基因I/D多態(tài)型與長(zhǎng)壽有密切關(guān)系。本研究中長(zhǎng)壽組DD基因型頻率明顯高于其余2組，D等位基因頻率高于對(duì)照組，講明DD基因型和D等位基因是長(zhǎng)壽的有利基因。Faure等研究發(fā)現(xiàn)法國(guó)百歲老人組D型等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，D型等位基因頻率在百歲組中更為常見。Davide等研究發(fā)現(xiàn)，意大利百歲老人中D/D基因型頻率及D型等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。而一項(xiàng)對(duì)歐洲人的研究講明，80歲以上老年組的ACEDD基因型和D等位基因頻率高于對(duì)照組，講明ACEDD基因型和D等位基因有助于健康和長(zhǎng)壽。而在我們國(guó)家對(duì)廣西巴馬壯族長(zhǎng)壽人群的調(diào)查中同樣發(fā)現(xiàn)，ACE基因的D/D基因型和D型等位基因與巴馬老人自然長(zhǎng)壽有關(guān)，可能有利于長(zhǎng)壽或其與長(zhǎng)壽關(guān)聯(lián)的可能性大，而I/I型很可能不利于長(zhǎng)壽或阻礙長(zhǎng)壽。載脂蛋白E〔apolipoproteinE,ApoE〕位于19號(hào)染色體上，具有6種表現(xiàn)型和3種等位基因。研究顯示，ApoE基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽、心血管疾病、老年癡呆等均有相關(guān)性。盡管在不同的人群中其基因型與長(zhǎng)壽關(guān)系不同，但在多個(gè)群體的證實(shí)ApoE是公認(rèn)的長(zhǎng)壽相關(guān)基因。本組研究中，長(zhǎng)壽組ε3/3基因型頻率較老年組升高〔P0.05〕，可能是有利于長(zhǎng)壽基因；長(zhǎng)壽組ε4/3基因型頻率較對(duì)照組明顯降低〔P0.001〕，較老年組也顯著降低〔P0.01〕，可能對(duì)長(zhǎng)壽不利。Schachter等報(bào)道法國(guó)百歲老人的ApoE基因型頻率中，ε2為12.8％明顯高于年輕對(duì)照組的6.8％，而ε4為5.8％，較對(duì)照組的11.2％明顯低，ε2和ε4在2組之間相差幾乎為2倍。由此以為法國(guó)老人長(zhǎng)壽與ApoE基因多態(tài)性相關(guān)，ε2具有延長(zhǎng)效應(yīng)，ε4則有縮短效應(yīng)。但是在本組研究中，ε2，ε4等位基因未表現(xiàn)出有差異。另有相關(guān)研究表示清楚，ε4等位基因具有明顯的升高血清總膽固醇，低密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白B的作用，而血脂代謝異常在冠心病發(fā)病中起重要作用。本研究中，3組間生化及體重指數(shù)、血壓等的比擬中，體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓表現(xiàn)出有差異，但均在正常范圍之內(nèi)，故在本研究中未進(jìn)一步研究。3組間低密度脂蛋白比擬也有差異，長(zhǎng)壽組血中低密度脂蛋白含量較老年組和對(duì)照組低，血中低密度脂蛋白含量高可引起血管中脂質(zhì)沉積增加、動(dòng)脈粥樣硬化，是心腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，因