專題五ＤNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題一ＤＮA的粗提取與鑒定一、提取DNA的溶解性原理涉及哪些方面？1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；ＤNA不溶于酒精。①DNA在不同濃度ＮaCl溶液中溶解度有何特點(diǎn)?要使ＤNA溶解，需要使用什么濃度?要使ＤＮA析出，又需要使用什么濃度？在０．14mｏｌ/Ｌ時(shí)溶解度最?。惠^高濃度可使ＤNＡ溶解;0.１4mｏl／L可使ＤNＡ析出。②在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí)，人們通常選用2mol/ＬN(yùn)aCl溶液；將DNＡ分子析出的方法是向溶有ＤNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋ＮａCｌ溶液。酒精是一種常用有機(jī)溶劑,但ＤNＡ卻不能溶于酒精（特別是95％冷卻酒精)，但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。2.從理論上分析,預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是克制核酸水解酶活性,防止DＮA降解；二是減少分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出;三是低溫有助于增長(zhǎng)DNＡ分子柔韌性，減少斷裂。３.采用DNA不溶于酒精的原理,可以達(dá)成什么目的?將DＮA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。?4.提取DNA還可以運(yùn)用DNＡ對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。運(yùn)用該原理時(shí),應(yīng)選用如何的酶和如何的溫度值?蛋白酶，由于酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，由于該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會(huì)變性。補(bǔ)充:DNA的變性是指ＤNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在8０℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在９５℃。5.洗滌劑在提取DNA中有何作用?洗滌劑將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì),從而崩潰細(xì)胞膜。6.當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí),需要使用什么指示劑進(jìn)行鑒定?在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。?? ? ??原理總結(jié)：通過(guò)運(yùn)用不同濃度NaＣｌ溶液溶解或析出DNＡ，可以從細(xì)胞中提取和提純DNＡ；再運(yùn)用酒精進(jìn)一步將ＤNA與蛋白質(zhì)分離開來(lái),達(dá)成提純的目的;最后運(yùn)用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。二、實(shí)驗(yàn)材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí),應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)因素。一是由于雞血細(xì)胞核的DＮA含量豐富,材料易得;二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)常需要?jiǎng)驖{和離心,對(duì)設(shè)備規(guī)定較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNＡ,容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DＮA的損失，最佳使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。三、破碎細(xì)胞，獲取含DNＡ的濾液１、若選用雞血和洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料，則如何獲取含ＤNA的濾液？在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌,過(guò)濾后收集濾液；切碎洋蔥,加入一定量洗滌劑和食鹽,攪拌研磨，過(guò)濾后收集濾液。２.為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂?答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用,就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出ＤNA。3．在以上實(shí)驗(yàn)中,加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過(guò)濾時(shí)應(yīng)當(dāng)選用(濾紙、尼龍布）。血細(xì)胞在蒸餾水中大量吸水而張裂;洗滌劑崩潰細(xì)胞膜;食鹽溶解DNA物質(zhì);選用尼龍布進(jìn)行過(guò)濾。4.在解決植物組織時(shí)需要進(jìn)行研磨,其目的是什么？研磨不充足產(chǎn)生什么結(jié)果?破碎細(xì)胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NａＣｌ溶液中；研磨不充足會(huì)使DNA的提取量減少,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。具體做法。10ｍL雞血＋20ｍL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過(guò)濾→濾液三、去除濾液中的雜質(zhì)1.為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，可以去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解DＮA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使ＤNA析出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就可以除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。最初獲得的DＮA濾液具有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步提純DNA。方案一的原理是DNＡ在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解ＤＮA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和ＤNA的變性溫度不同。方案二與方案三的原理有什么不同?答:方案二是運(yùn)用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的ＤNA與蛋白質(zhì)分開;方案三運(yùn)用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與ＤNA分離。四、析出與鑒定1．在濾液中仍然具有一些雜質(zhì)，如何除去這些雜質(zhì)呢?得到的DＮA呈何顏色？濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻,靜置２~3分鐘,析出的白色絲狀物就是DNA。ＤNA呈白色。2.如何鑒定析出的白色絲狀物就是ＤＮA呢?具體做法。試管2支，編號(hào)甲乙→各加等量5mLNaCｌ溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mＬ二苯胺,混合均勻→沸水浴5miｎ→觀測(cè)顏色變化五、實(shí)驗(yàn)操作制備雞血細(xì)胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓破碎細(xì)胞,釋放DNＡ…加蒸餾水,同一方向快速通方向攪拌↓→過(guò)濾,除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。溶解核內(nèi)DNA…………加入ＮａＣｌ至2ｍoｌ/L，同一方向緩慢攪拌↓DＮA析出………………加蒸餾水至0．14moｌ/Ｌ,過(guò)濾，在溶解到２mol/L溶液中↓→除去細(xì)胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。ＤNA初步純化…………與等體積95%冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、ＲＮA、多糖等。DNA鑒定………………二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色注意事項(xiàng)：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固;雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度；使用塑料燒杯;使用尼龍布過(guò)濾;玻棒沿同一方向攪拌;玻棒攪拌要緩慢（細(xì)胞破裂快速攪拌);玻棒不要碰到燒杯壁;二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒从硵U(kuò)增DNA片段基礎(chǔ)知識(shí)ＰCＲ技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程,與細(xì)胞內(nèi)ＤＮA復(fù)制過(guò)程類似:1.細(xì)胞內(nèi)DＮA復(fù)制條件分析：條件組分作用模板ＤNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DＮA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成ＤNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RＮA為DNA聚合酶提供合成的３’端起點(diǎn)2．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程的解析：解旋：解旋酶、ATＰ，DNA兩條鏈打開，形成兩條DＮA單鏈。引物結(jié)合:在DＮA單鏈3’端與ＤＮA反向配對(duì)結(jié)合。ＤＮA聚合酶結(jié)合：DＮA聚合酶與模板鏈結(jié)合，標(biāo)志著單鏈合成開始。子鏈合成：ＤNA聚合酶從引物3’端開始，將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,再由ＤNA連接酶將不連續(xù)的ＤNA子鏈連接起來(lái)（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈,滯后鏈）3．ＤNA分子復(fù)制的人工控制實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)照PＣR反映體系配方配制反映液;②將ＰCR反映體系５0μＬ用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL)中；③將微量離心管放到PCR儀中；④設(shè)立PCR儀的工作參數(shù)。⑤DNＡ在ＰCR儀中大量擴(kuò)增。4．實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1)避免外源DNＡ污染:所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。（2）緩沖液和酶分裝成小份,-20℃低溫保存。(3)每添加一種反映成分,更換一個(gè)移液器的槍頭。(4）混勻后離心解決,使反映液集中在離心管底部。總結(jié)、點(diǎn)評(píng)多聚酶鏈?zhǔn)椒从硵U(kuò)增DNA片段多聚酶鏈?zhǔn)椒从硵U(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過(guò)程變性復(fù)性延伸操作環(huán)節(jié)配制PCR反映體系移入離心管放入PCR設(shè)立工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算課題三血紅蛋白的提取和分離一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì):形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1.凝膠色譜法(分派色譜法）:(１）原理：分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng),流動(dòng)慢。（２)凝膠材料:多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。(3)分離過(guò)程：混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。(4)作用：分離蛋白質(zhì),測(cè)定生物大分子分子量,蛋白質(zhì)的脫鹽等。2．緩沖溶液(1）原理:由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3－ＮaＨＣO3，ＮaＨ2PO４/Nａ2HＰO４等)，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pＨ的干擾而保持ｐH穩(wěn)定。3.凝膠電泳法：(1)原理:不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過(guò)程：在一定ｐH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電;加入帶負(fù)電荷多的SDS,形成“蛋白質(zhì)－SDＳ復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)１.樣品解決紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞,然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min,低速短時(shí)間離心,如此反復(fù)洗滌三次,直至上清液中沒(méi)有黃色，表白紅細(xì)胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有助于血紅蛋白的釋放和分離。2．粗分離①分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后,試管中的溶液分為4層。第一層為無(wú)色透明的甲苯層,第２層為白色薄層固體,是脂溶性物質(zhì)的沉淀層,第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾,除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置半晌后,分出下層的紅色透明液體。②透析取1ｍL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為２0ｍmｏｌ/L的磷酸緩沖液中,透析1２h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。３．純化調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝↓膠面平齊，關(guān)閉出口。加入蛋白質(zhì)樣品:用吸管將透析后的樣品沿管壁圍繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后，∣打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi),等樣品完全滲入凝膠層后，↓關(guān)閉出口。調(diào)節(jié)緩沖液面：加入20mmol／L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度↓洗脫:連接緩沖液洗脫瓶,打開下端出口，進(jìn)行洗脫。↓收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí),用試管收集。4．純度鑒定－－---－SDＳ聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做)三、注意事項(xiàng)電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下,運(yùn)用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子自身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而達(dá)成對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2.紅細(xì)胞的洗滌假如分層不明顯，也許是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的因素。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀,也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3．如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈,檢查凝膠是否裝填得均勻。此外,還可以加入大分子的有色物質(zhì),觀測(cè)色帶移動(dòng)的情況。假如色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。假如色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻?假如凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙,使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò),攪亂洗脫液的流動(dòng)順序，影響分離的效果。５.沸水浴解決加入洗脫液的濕凝膠的目的不僅節(jié)約時(shí)間,還能除去凝膠中也許帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。6.G-７5“G”代表凝膠的交聯(lián)限度,膨脹限度及分離范圍,75表達(dá)凝膠得水值,即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.５ｇ。7.裝填完后,立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密８．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌?防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅