蛋白質(zhì)測序儀蛋白質(zhì)的氨基酸序列確定

每一種蛋白質(zhì)都具有唯一的氨基酸序列。實(shí)際上蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由DNA決定的。一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)A.蛋白質(zhì)的氨基酸組成的定量確定酸水解：破壞蛋白質(zhì)的肽鍵柱層析：進(jìn)行氨基酸定量分析，每個(gè)氨基酸的量與洗脫峰的面積成比例。氨基酸分析儀器B.Edman降解方法常用于氨基酸序列的測定1、

Edman法（1）耦聯(lián)

PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-D（2）裂解無水三氟乙酸（TFA）

ATZ—A+H2N—B-C-D（3）轉(zhuǎn)化PTH—APTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）

第一輪降解第二輪降解PTH－丙氨酸少了一個(gè)氨基酸殘基的肽2、

DNS-Edman法用DNS法測N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，簡稱DNS-C1)在堿性條件下與氨基酸(肽或蛋白質(zhì))的氨基結(jié)合成帶有熒光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白質(zhì))，DNS-蛋白質(zhì)再經(jīng)酸水解可釋放出DNS-氨基酸。DNS-C1能與所有的氨基酸生成具熒光的衍生物，其中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成雙DNS-氨基酸衍生物。這些衍生物相當(dāng)穩(wěn)定，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成的微量分析，靈敏度可達(dá)10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比過去常用的FDNB法高100倍。將Edman法和DNS法結(jié)合起來(稱為Edman-DNS法)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的序列分析上作，可以提高Edman法的靈敏度及其分析速度。

3、

有色Edman法熒光基-團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’異硫氰酸酯。4、

用自動序列分析儀測序儀器原理：Edman法。1967液相測序儀自旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測序儀用Polybrene反應(yīng)器。（聚陽離子）四級銨鹽聚合物液相：5nmol20-40肽97%

氣相：5pmol60肽98%二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定二硫鍵的確定（對角線電泳法）碘乙酰胺封閉-SH胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)第一向電泳過甲酸氧化—S—S—生成-SO3H第二向電泳分離出含二硫鍵的兩條短肽，測序與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。酰胺的確定Asp–Asn、Glu-Gln酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn舉例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0時(shí)，電荷量是Leu+Pro0Val-

此肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。糖、脂、磷酸基位置的確定糖類通過Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-N-糖苷-0-糖苷脂類：Ser、Thr、Cys磷酸：Ser、Thr、His經(jīng)驗(yàn)性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)C.大蛋白被水解成肽段后再測序

Edman降解法測序一次只能連續(xù)降解幾十個(gè)氨基酸殘基。要測定大的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，需要將蛋白質(zhì)降解為一些肽段，然后再進(jìn)行Edman降解測序。溴化氰（BrCN）：可以特異與蛋白質(zhì)中的蛋氨酸殘基反應(yīng)生成一個(gè)C末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽和一個(gè)帶有新的N

末端殘基的肽。胰蛋白酶：特異地催化賴氨酸（Lys）殘基和精氨酸（Arg）殘基羧基側(cè)的肽鍵的水解，胰凝乳蛋白酶：特異地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）三種芳香族氨基酸殘基羧基一側(cè)的肽鍵水解。肽段拼接成肽鏈16肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT

Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS胰蛋白酶作用胰凝乳蛋白酶