梅毒螺旋體的實驗室常見的診斷方法綜述,性醫(yī)學(xué)論文梅毒危害極大,在我們國家曾一度被消滅,但隨著近年來對外溝通的日益頻繁又死灰復(fù)燃,發(fā)病率呈逐年上升趨勢。2020年國家衛(wèi)生部頒布的甲、乙類法定報告?zhèn)魅静≈?梅毒發(fā)病率較2018年上升3.27%,死亡率上升5.36%,應(yīng)引起重視。因而早期檢出患者,及時治療,控制傳染源,是控制梅毒傳播的重要措施。梅毒檢測方式方法有多種,現(xiàn)就梅毒螺旋體的實驗室常見的診斷方式方法作一扼要綜述。1、病原體的檢測對患者分泌物進(jìn)行觀測,如發(fā)現(xiàn)運動的蒼白螺旋體即可確診為梅毒,該方式方法特異性高,但靈敏度稍低,容易漏檢。梅毒檢測適用于早期梅毒皮膚黏膜損害,對硬下疳尤為重要,由于人體感染TP3~6周后,才能通過梅毒螺旋體抗原血清試驗(TPHA)、梅毒熒光抗體(FTA)等敏感性、特異性較高的方式方法檢測到血清中的抗體,在患者血清抗體到達(dá)可測水平之前,TP檢查是早期診斷梅毒最好的方式方法。1.1暗視野顯微鏡(DF)檢查梅毒螺旋體暗視野檢查法是梅毒病原體檢測的主要方式方法。在皮損處,用玻片刮取組織滲出液或淋逢迎穿刺液,用500暗視野顯微鏡觀察,在暗背景上,梅毒螺旋體呈白色發(fā)光、運動快速、急促,可以較緩慢地圍繞長軸旋轉(zhuǎn)。根據(jù)其典型的形態(tài)、大小和運動方式,結(jié)合臨床異常感覺和狀態(tài)可直接診斷梅毒。暗視野檢查法特異性高,適用于早期梅毒的診斷。但由于受病程、取材、檢測人員技術(shù)水平以及部分患者不規(guī)則使用抗生素導(dǎo)致TP數(shù)量減少和活動力下降的影響,敏感性較低為54.4%,因而此法檢查陰性也不能排除患梅毒的可能。該法簡單、快速,但不適用于潛伏及晚期梅毒患者。且口腔中可能存在其他螺旋體,因而此法對口腔病灶材料亦不適用。1.2活體組織檢查梅毒螺旋體常用銀染色法(war-thin-starry)或直接熒光抗體試驗(DFAT)檢查活體組織梅毒螺旋體。銀染色法能使梅毒螺旋體染成棕褐色或黑褐色,形態(tài)清楚明晰易辯,且標(biāo)本能夠永久保存。但由于存在梅毒螺旋體類似物質(zhì)的干擾,因而,銀染色陽性結(jié)果的判定應(yīng)慎重。特異性熒光抗體試驗是用非致病性螺旋體培養(yǎng)物對抗梅毒螺旋體抗血清或單克隆抗體吸收后,再與異硫氰酸熒光素(FITC)相結(jié)合,在熒光顯微鏡下判讀結(jié)果。梅毒螺旋體發(fā)特異性黃綠色熒光,靈敏性稍高于暗視野檢查法?？捎糜诿范韭菪w與類似螺旋體的鑒別。1.3多功能超高倍顯微診斷儀(MDI)是一種集光學(xué)、光電學(xué)、電子學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)和多媒體計算機技術(shù)于一體的高科技醫(yī)學(xué)顯微設(shè)備,其具有共軛變焦、高清楚明晰度、高分辨率、高放大倍率的特點,有效放大倍率可達(dá)20000倍以上。能夠快速、便捷的進(jìn)行標(biāo)本觀測。其在Ⅰ期梅毒診斷的陽性率為83.75%,但由于設(shè)備昂貴難以普及。2、梅毒血清學(xué)檢查機體感染梅毒螺旋體后可產(chǎn)生兩種抗體,一種是抗梅毒螺旋體的特異性抗體(IgM和IgG);一種是非梅毒螺旋體特異性的抗體,即反響素。梅毒血清學(xué)檢查包括非梅毒螺旋體抗體檢測(非特異性抗體檢測)和特異性梅毒螺旋體抗體檢測。前者敏感性、特異性均較后者低,但由于抽血后1h即可出結(jié)果,費用也低廉,因而常用于臨床挑選。并且非特異性抗體在治療后下降或消失,因而可斷定治療效果。后者敏感性和特異性均較高,主要用于確認(rèn)試驗,但由于其不隨治療下降或消失,故不能用于斷定治療效果。2.1非梅毒螺旋體血清試驗非梅毒螺旋體血清試驗檢測的為非特異性抗體(反響素),某些其他疾病患者如結(jié)核、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、猩紅熱等甚至健康人中可以出現(xiàn)反響素,因而可出現(xiàn)生物學(xué)假陽性。除此之外,標(biāo)本溶血或容器污染等亦可引起假陽性反響,其特異性較低。經(jīng)治療后患者反響素可消失或陰轉(zhuǎn),通常用于療效觀察、判定復(fù)發(fā)及再感染。2.1.1性病研究實驗室試驗(VDRL):以心磷脂、膽固醇及卵磷脂的混懸液作為抗原,與機體產(chǎn)生的反響素在體外發(fā)生反響。屬于微量玻片法,操作簡單、快速,對診斷神經(jīng)梅毒有重要價值,敏感性可達(dá)99%,特異性達(dá)70.8%?？勺鞫考岸ㄐ栽囼?但對一期梅毒敏感性低。2.1.2快速血漿反響素環(huán)狀卡片試驗(RPR):VDRL試驗的改進(jìn)。用標(biāo)準(zhǔn)活性炭顆粒吸附VDRL抗原,操作簡單、快速,結(jié)果易于觀察,靈敏度較VDRL高,是當(dāng)前臨床應(yīng)用最多的檢測方式方法之一。RPR可檢測滴度,滴度可在治療后半年到2年下降4倍,滴度變化是觀察治療效果、復(fù)發(fā)或再感染的重要指標(biāo)。RPR試驗和DF方式方法相結(jié)合,可早期診斷梅毒。其缺點是反響素水平過高可產(chǎn)生假陰性結(jié)果。該法對神經(jīng)梅毒、潛伏期梅毒不敏感。2.1.3不加熱血清反響素玻片試驗(USR):為改進(jìn)的VDRL試驗,待檢血清不需加熱滅活,直接在玻片上進(jìn)行絮狀反響,肉眼判讀結(jié)果。此法敏感性高而特異性較低,易發(fā)生生物學(xué)假陽性,亦可作為療效觀察、判定復(fù)發(fā)或再感染的指標(biāo)。2.1.4甲苯胺紅不加熱血清實驗(TRUST):其原理是以甲胺苯紅染料顆粒代替炭顆粒作為指示物,當(dāng)液體中出現(xiàn)凝集程度不同的紅色凝塊時即判為陽性,簡便快速,結(jié)果判讀以白色紙卡為背景,清楚明晰易判,穩(wěn)定性好。對于非梅毒螺旋體特異性抗體的檢測,TRUST法的檢出率和重復(fù)性均優(yōu)于RPR法。但由于在梅毒感染的早期和潛伏期,血清中反響素很少,其檢出率亦較低,分別為72.7%和73.7%。2.2梅毒螺旋體血清試驗此類試驗采用的抗原是梅毒螺旋體或其成分,檢測血清中的抗梅毒螺旋體IgM和/或IgG抗體,其敏感性和特異性均較高,一般用作確證試驗。但由于特異性IgG抗體可終身存在,因而不能用作療效觀察。2.2.1梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA):該法使用甲醛處理的羊紅細(xì)胞做抗原載體,吸附從兔睪丸中提取后經(jīng)超聲波粉碎的Nichols株梅毒螺旋體菌體抗原,檢測血清中抗梅毒螺旋體特異性抗體。為排除非特異性反響,待測血清需經(jīng)吸收劑(兔睪丸提取物、正常兔血清及超聲處理的密螺旋體無毒株Reiter株)吸收,因而TPHA具有高度的敏感性和特異性,是當(dāng)前臨床常用的梅毒血清學(xué)確證試驗。其缺點是抗原制備困難,試劑較昂貴,操作較繁瑣,且易發(fā)生自凝現(xiàn)象。2.2.2梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA):TPPA與TPHA不同的是用明膠顆粒代替羊紅細(xì)胞做抗原載體,吸附梅毒螺旋體Nichols株菌體抗原,進(jìn)而避免了TPHA法血球易自凝而造成的漏診。TPPA敏感度和特異性均較高,分別為99.2%和97.0%,在臨床上亦常用于梅毒血清學(xué)確證試驗。該法操作簡便、快速,結(jié)果易于判定,但同樣由于試劑價格較昂貴而使其在臨床的大規(guī)模使用遭到限制。2.2.3熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS):是一種間接熒光抗體法,其先以密螺旋體無毒株(Reiter株)超聲裂解抗原吸收待檢血清,除去具有穿插反響的抗體,再與梅毒螺旋體菌體作用,然后參加熒光素標(biāo)記的抗人IgG。此法敏感性、特異性均較高,文獻(xiàn)報道FTA-ABS對各期梅毒檢測的特異性到達(dá)92%,對一期梅毒敏感性為80%,二期為99%~100%,三期為95%~100%,亦常被用做確證試驗。FTA-ABS-19S-IgM試驗是先將血清中IgG和IgM分離,再用FTA-ABS法檢測19S-IgM抗體,避免了母體IgG的干擾,常用于新生兒先天梅毒血清學(xué)的診斷試驗,是早期確診先天梅毒的重要手段。其缺點在于步驟繁瑣,操作費時,結(jié)果判讀易受操作人員經(jīng)歷體驗的影響。2.2.4快速乳膠凝集試驗(syphilisfasttest):本試驗是將梅毒螺旋體TpN15、TpN17與TpN47重組抗原結(jié)合到乳膠顆粒上,當(dāng)血清中存在特異性梅毒螺旋體抗體時,即可發(fā)生凝集反響。其與TPPA一致率可達(dá)98.8%,有一定的敏感性和特異性。該試驗操作簡單、快速,合適門診梅毒檢測。2.2.5梅毒螺旋體免疫印跡技術(shù)(WB):該法將免疫學(xué)的特異性和分子生物學(xué)的靈敏性相結(jié)合,具有敏感性高、特異性強的特點。Byrne等用免疫印跡法檢測梅毒螺旋體抗體時,以為只要當(dāng)15.5、17、44.5、47kDa4個抗原中的3個被檢測到才能判定為陽性,其敏感性為98%,特異性為100%。診斷梅毒的靈敏性優(yōu)于FTA-ABS約3~4個血清稀釋度。對神經(jīng)性梅毒檢測的陽性率為100%。此法操作簡便,特異性好,結(jié)果易判,但成本較高。2.2.6梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(TP-ELISA):是將梅毒螺旋體TpN15、TpN17與TpN47重組抗原包被在微孔板上,采用雙抗原夾心法檢測梅毒螺旋體特異性抗體。其原理是利用包被的梅毒特異性抗原對血清中的抗體進(jìn)行初篩,然后通過酶標(biāo)記的特異性抗原再次進(jìn)行挑選,因而增加了結(jié)果的特異性。該法可同時檢測IgM、IgG抗體,縮短了窗口期,提早了對感染后的檢出,十分是TP-IgM對早期梅毒、先天梅毒的診斷有重要意義。文獻(xiàn)報道TP-ELISA方式方法的敏感性高于熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS),對一期梅毒的診斷靈敏度為93.8%,且生物學(xué)假陽性和假陰性發(fā)生率明顯低于RPR。該方式方法操作簡單,易于自動化,合適大批量樣本檢測,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,被公以為梅毒血清學(xué)診斷試驗的首選方式方法。2.2.7梅毒膠體金法(ICS):金標(biāo)法是一種快速體外診斷技術(shù)。應(yīng)用基因重組技術(shù)制備梅毒螺旋體特異性基因工程抗原,采用膠體金標(biāo)記和免疫層析技術(shù),能夠高度特異的檢測待測血清中的抗體?？捎糜谌⒀獫{、血清的檢測,靈敏度高,可用于梅毒的快速檢測和相關(guān)篩查。膠體金法檢測TP-IgM還可用于診斷梅毒復(fù)發(fā)和再感染的檢測。2.2.8化學(xué)發(fā)光法(CMIA):將TP抗原包被到固體鐵粒子上,使其與標(biāo)本中的抗TP抗體反響,再與酶標(biāo)抗人IgG抗體結(jié)合,構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物后,參加化學(xué)發(fā)光基質(zhì),根據(jù)化學(xué)發(fā)光基質(zhì)的發(fā)光量可計算出標(biāo)本中抗TP抗體的含量。Knight等報導(dǎo)應(yīng)用此法檢測梅毒患者血清有很好的敏感性(95.8%~100%)和特異性(99.1%~100%)。但由于試劑成本較高且需要特殊儀器,當(dāng)前未在臨床得到廣泛應(yīng)用。3、分子生物學(xué)技術(shù)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,應(yīng)用PCR技術(shù)檢測梅毒螺旋體DNA已在臨床得到應(yīng)用?，F(xiàn)PCR診斷梅毒的方式方法主要有常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)、巢式PCR。Liu等應(yīng)用PCR技術(shù)檢測生殖器潰瘍標(biāo)本polA基因,敏感性為95.8%,特異性為95.7%。Leslie等應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測患者標(biāo)本polA基因,敏感性為80.39%,特異性為98.40%。PCR技術(shù)敏感性高,但存在難于標(biāo)準(zhǔn)化的問題,其原因主要是由于引物來源不同以及各實驗室間DNA抽提方式方法存在差異不同,且臨床標(biāo)本成分復(fù)雜,也進(jìn)一步導(dǎo)致了該法難于標(biāo)準(zhǔn)化。所以建立對梅毒螺旋體高度特異的PCR方式方法尤為重要。PCR技術(shù)是梅毒血清學(xué)試驗的有益補充,在早期梅毒診斷中發(fā)揮重要作用。綜上所述,應(yīng)根據(jù)研究目的選擇恰當(dāng)?shù)脑囼灧绞椒椒ā．?dāng)前,國內(nèi)實驗室在進(jìn)行梅毒常規(guī)篩查及療效觀察、判定復(fù)發(fā)及再感染時常采用梅毒非特異性血清學(xué)試驗(RPR、TRUST等);各期梅毒確實診試驗常采用梅毒的特異性血清學(xué)試驗(TPPA、TPHA等);進(jìn)行大規(guī)模梅毒篩查常采用雙抗原夾心法ELISA。隨著檢測