時(shí)間分辨熒光蛋白Time-ResolvedProteinFluorescence熒光蛋白的時(shí)間分辨測量time-resolvedmeasurementsofprotein

fluorescence越來越普遍原因：時(shí)域（TD）和頻域（FD）儀器越來越可靠研究的挑戰(zhàn)缺少簡單的脈沖光源從蛋白質(zhì)隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)解釋該現(xiàn)象1、蛋白質(zhì)的熒光的單光子激發(fā)需要波長在280至305納米的范圍內(nèi)。2、蛋白質(zhì)熒光激發(fā)脈沖激光二極管尚未公布。脈沖LED用于蛋白質(zhì)的熒光激發(fā)剛剛宣布，但脈沖寬度超過1納秒。3、最近的研究所用的脈沖將Ti的三倍頻輸出：藍(lán)寶石激光或同步加速器輻射。缺乏的認(rèn)識(shí)色氨酸本身的強(qiáng)度衰減多個(gè)色氨酸殘基存在于一個(gè)單一的蛋白質(zhì)，并顯示在復(fù)雜的衰變動(dòng)力學(xué)當(dāng)中色氨酸本身在在中性pH溶液中顯示一個(gè)多指數(shù)或者非指數(shù)衰減1.INTENSITYDECAYSOFTRYPTOPHAN:

THEROTAMERMODEL色氨酸旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型的強(qiáng)度衰變用時(shí)間分辨在解釋蛋白質(zhì)的衰變強(qiáng)度時(shí)的困難在于對色氨酸本身強(qiáng)度衰減缺乏了解在中性水溶液中的色氨酸的強(qiáng)度衰減是一種已知的雙指數(shù)衰減，時(shí)間近3.1和0.5ns色氨酸雙指數(shù)衰變占主導(dǎo)地位是由于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的存在芳香族氨基酸和相關(guān)化合物在20°C，pH值7時(shí)的強(qiáng)度衰減吲哚色氨酸NATA酪氨酸O-甲基酪氨酸在溶液中的色氨酸側(cè)鏈采用不同的構(gòu)象，一個(gè)色氨酸溶液可以被視為一個(gè)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的混合物，即所謂的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。在中性水溶液中，色氨酸兩性離子形式時(shí)氨基被質(zhì)子化（NH3+）和羧基電離（CO2–）。在溶液中的色氨酸能自淬滅，涉及吲哚環(huán)和帶正電荷的銨基團(tuán)。色氨酸也可以由氨基酸側(cè)鏈淬火銨基淬火依賴于一定PH下色氨酸熒光量子產(chǎn)率隨著pH從8提高到10的氨基發(fā)生解離，量子產(chǎn)量和平均壽命增加約三倍如何通過氨基淬火解釋

色氨酸在pH值為7的雙指數(shù)衰減？旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體在淬火過程顯示了比0.5納秒短的衰減時(shí)間旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的存在可能是在中性pH值色氨酸的多指數(shù)衰減的主要的原因酪氨酸和色氨酸及其中性的結(jié)構(gòu)類似物2.TIME-RESOLVEDINTENSITYDECAYSOF

TRYPTOPHANANDTYROSINE

色氨酸和酪氨酸的時(shí)間分辨強(qiáng)度衰變

過去不能夠可靠地解決其衰減時(shí)間和幅度現(xiàn)在已知的0.5-和3.1-ns衰減組件顯示不同的發(fā)射光譜2.1色氨酸的衰變相關(guān)的發(fā)射光譜假設(shè)一個(gè)樣本顯示多指數(shù)衰減，其衰減在不同的發(fā)射波長不同。然后描述的強(qiáng)度衰減中αi（λ）是與波長相關(guān)的指數(shù)前因素和τi的衰減時(shí)間。這個(gè)表達(dá)式假設(shè)衰減時(shí)間與波長無關(guān)。發(fā)射光譜由于每個(gè)組件可以計(jì)算的短期和長期ns色氨酸的衰減成分的光譜分辨率

2.2酪氨酸及其中性衍生物的強(qiáng)度衰變酪氨酸也可以顯示復(fù)雜的衰變動(dòng)力學(xué)，但其性質(zhì)與色氨酸是相反的。酪氨酸及其中性類似物

N-乙?；?L-酪氨酰胺的頻域的強(qiáng)度衰減酪氨酸本身顯示一個(gè)單指數(shù)衰變而NATyrA顯示一個(gè)雙指數(shù)衰變（可能是基態(tài)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的存在）酪氨酸在水中的強(qiáng)度衰減通常是一個(gè)單一的指數(shù)3.INTENSITYANDANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的強(qiáng)度和各向異性衰變由于NATA顯示一個(gè)衰減時(shí)間，我們可以預(yù)期單色氨酸的蛋白質(zhì)，顯示單指數(shù)衰減。但是大多數(shù)單-色氨酸的蛋白質(zhì)顯示雙重或三重指數(shù)衰減3.1單指數(shù)強(qiáng)度和核糖核酸酶T1的各向異性衰減最單一的色氨酸蛋白顯示多指數(shù)衰減。然而，有有兩個(gè)已知的例外天青蛋白、核糖核酸酶T1米曲霉。大多數(shù)的核糖核酸酶不包含色氨酸。核糖核酸酶T1，它包含一個(gè)不尋常的單一的色氨酸殘基，一些條件下表現(xiàn)一個(gè)單指數(shù)衰減核糖核酸酶T1由

104個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽

在2’-存在的核糖核酸酶T1結(jié)構(gòu)GMP（2′-GMP刪除）。59色氨酸位于α-螺旋和表之間的結(jié)構(gòu)。核糖核酸酶T1有四個(gè)苯丙氨酸，九個(gè)酪氨酸，和一個(gè)單一的—色氨酸殘基在位置59。色氨酸殘基的活性位點(diǎn)附近。時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度和各向異性

在緩沖水溶液的pH值5.5的核糖核酸酶T1衰減該衰變成為在pH7雙指數(shù)。單指數(shù)衰變是方便的，因?yàn)樽兓牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)可以被預(yù)期會(huì)導(dǎo)致更復(fù)雜的衰減動(dòng)力學(xué)。檢測出單指數(shù)衰變成為多指數(shù)衰減比檢測在一個(gè)多指數(shù)衰減的變化簡單一些3.2膜聯(lián)蛋白V：鈣離子敏感的單色氨酸蛋白質(zhì)對于大多數(shù)的蛋白質(zhì)，甚至與單色氨酸殘基，強(qiáng)度和各向異性衰減更為復(fù)雜。一個(gè)例子是膜聯(lián)蛋白V，它具有一個(gè)單一的色氨酸殘基膜聯(lián)蛋白是一類同源蛋白以鈣依賴性方式結(jié)合到細(xì)胞膜上。在不存在鈣時(shí)膜聯(lián)蛋白V呈高度非指數(shù)的強(qiáng)度衰減鈣會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)度衰減變得更像一個(gè)單一的指數(shù)。表明了附近的淬滅基團(tuán)在無鈣的形式存在晶體膜聯(lián)蛋白Ⅴ的結(jié)構(gòu)是與該現(xiàn)象一致，因?yàn)樵阝}的存在下色氨酸殘基移離蛋白質(zhì)3.3有兩個(gè)色氨酸蛋白質(zhì)的各向異性衰減在多色氨酸殘基的蛋白中，每個(gè)殘基可以是剛性的或移動(dòng)的。在相同的蛋白質(zhì)色氨酸殘基在不同的位置可以有不同的運(yùn)動(dòng)和各向異性衰變。時(shí)間分辨的單色氨酸的各向異性衰變的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體。296nm激發(fā)4.ANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的各向異性衰變前面我們看到的與蛋白質(zhì)的研究基于色氨酸殘基的數(shù)量有限色氨酸殘基的數(shù)目增加時(shí)，它變得不切實(shí)際解決個(gè)別殘基在這樣的情況下，必須翔實(shí)的研究野生型蛋白質(zhì)的壽命分布相移和解調(diào)的頻率依賴性在學(xué)葉菌的β-葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射因素

中性pH在5，45和85℃。在所指示的溫度S.葉菌β-色氨糖苷酶壽命分布衰變是高度異質(zhì)性，解釋雙峰壽命分布方面，隨著溫度的增加，這兩個(gè)組逐步向更短的壽命遷移5.TIME-DEPENDENTSPECTRAL

RELAXATIONOFTRYPTOPHAN

色氨酸的光譜松弛時(shí)間在這一分析，我們假設(shè)每個(gè)色氨酸殘基在所有的波長顯示相同的壽命。然而，一個(gè)單一的色氨酸殘基的壽命可能不是在所有的發(fā)射波長相同。吲哚甘油20°C的強(qiáng)度衰減不同的波長的發(fā)射光譜進(jìn)行測量強(qiáng)度衰減強(qiáng)度衰減在310nm處，藍(lán)色波長比在390納米衰減得更迅速強(qiáng)度衰減在380nm處顯示的上升時(shí)間是一個(gè)激發(fā)態(tài)過程的證明衰變相關(guān)光譜（頂部）和時(shí)間分辨發(fā)射譜（下）。DAS和TRES是從吲哚的甘油在20℃下相同時(shí)間分辨衰變計(jì)算出來衰變相關(guān)的光譜和時(shí)間分辨發(fā)射

從譜圖，在30℃，289-nm激發(fā)髓鞘堿性蛋白6.PERSPECTIVESONPROTEINFLUORESCENCE

透視熒光蛋白大量的蛋白結(jié)構(gòu)的可用性允許的蛋白質(zhì)和它們的光譜特性的結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)性研究。如其中側(cè)鏈?zhǔn)亲钣锌赡芤遭缟彼帷Ｄ芰哭D(zhuǎn)移從短到長波長色氨酸已經(jīng)看到了幾種蛋白質(zhì)。發(fā)射最大值可以是與曝光相關(guān)溶劑，從蛋白質(zhì)看去結(jié)構(gòu)。熒光蛋白的更加深刻的理解將允許它的使用來回答更具體的問題關(guān)于蛋白質(zhì)功能和蛋白質(zhì)的相互作用與其他生物分子。多光子激發(fā)顯微鏡MultiphotonExcitationandMicroscopy多光子激發(fā)特點(diǎn)激發(fā)波長：兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā),激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍多光子激發(fā)：依賴于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間：使用脈沖飛秒激光器(i.e.10-16seconds),且能提供更高的峰值功率；熒光限制在焦點(diǎn)處，能滿足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于激光強(qiáng)度多光子激發(fā)---一個(gè)非線性過程多光子與單光子比較

單光子

雙光子*照明錐體大體積激發(fā)

*激發(fā)局限在焦點(diǎn)