標(biāo)準(zhǔn)解讀

《GB/T 36820-2018 甘蔗條紋花葉病毒實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法》是一項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，主要針對(duì)甘蔗條紋花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）的檢測(cè)提供了具體的操作指南。該標(biāo)準(zhǔn)適用于甘蔗種植區(qū)域中SCSMV的快速、準(zhǔn)確鑒定。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，首先明確了所需的主要試劑與材料，包括但不限于RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs混合物以及特異性引物和探針等。這些物質(zhì)的選擇直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

接著詳細(xì)描述了樣本采集的方法，指出應(yīng)從疑似感染植株上選取具有典型癥狀的新鮮葉片作為待測(cè)樣品，并且強(qiáng)調(diào)了采樣時(shí)需要注意避免交叉污染，確保每個(gè)樣品獨(dú)立處理。

在核酸提取部分，推薦使用商業(yè)化的RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以獲得高質(zhì)量的總RNA。同時(shí)，對(duì)于可能出現(xiàn)的問(wèn)題如降解或抑制劑殘留也給出了相應(yīng)的預(yù)防措施。

RT-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建方面，則是基于SYBR Green I染料法或者TaqMan探針?lè)▉?lái)進(jìn)行設(shè)置。標(biāo)準(zhǔn)中列舉了兩種方法的具體參數(shù)配置，包括反應(yīng)體積、各組分濃度比例及循環(huán)條件等關(guān)鍵信息。此外，還特別指出了如何通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析來(lái)區(qū)分非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與目標(biāo)序列。


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....

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  • 2018-09-17 頒布
  • 2019-04-01 實(shí)施
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GB/T 36820-2018甘蔗條紋花葉病毒實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

ICS6502001

B16..

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T36820—2018

甘蔗條紋花葉病毒實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶

鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測(cè)方法

()

DetectionmethodofSugarcanestreakmosaicvirusbyreal-timereverse

transcritionolmerasechainreactionRT-PCR

ppy()

2018-09-17發(fā)布2019-04-01實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T36820—2018

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口

(SAC/TC271)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試

:、

中心農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

、。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人高三基黃美婷傅華英孫生仁張慧麗王錦達(dá)陳如凱

:、、、、、、。

Ⅰ

GB/T36820—2018

甘蔗條紋花葉病毒實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶

鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測(cè)方法

()

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘蔗條紋花葉病毒Suarcanestreakmosaicvirus實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

(g)

應(yīng)檢測(cè)方法的儀器與設(shè)備試劑與材料樣品的采集與前處理檢測(cè)以及結(jié)果判斷與表述等

(RT-PCR)、、、。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于可能帶有甘蔗條紋花葉病毒的活體寄主植物的快速檢測(cè)診斷

、。

2縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

。

外殼蛋白

CP:(coatprotein)

值實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:PCR,(cycle

threshold)

與鏈互補(bǔ)的單鏈

cDNA:RNADNA(complementaryDNA)

Taq酶熱啟動(dòng)聚合酶

ExHS:DNA(hotstartDNApolymerase)

羧基熒光素

FAM:6-(6-carboxy-fluorescein)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR:(polymerasechainreaction)

核糖核酸

RNA:(ribonucleicacid)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

RT-PCR:(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)

甘蔗條紋花葉病毒Sugarcanestreakmosaicvirus

SCSMV:()

羧基四甲基羅丹明

TAMRA:6-(6-carboxytetramethylrhodamine)

吸頭

Tip:

3方法原理

根據(jù)甘蔗條紋花葉病毒基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)僅在該病毒基因間保守的特異性引物和一條特

CPCP

異性的熒光雙標(biāo)記水解型寡核苷酸探針探針首先利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒反轉(zhuǎn)成

(TaqMan)。RNA

再以為模板在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)水解型寡核苷酸探針

cDNA,cDNAPCR,

探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度伴隨著目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物的增加呈正比關(guān)系通過(guò)收集擴(kuò)

(TaqMan)PCR,PCR

增過(guò)程的熒光信號(hào)值即可判斷試樣是否帶有目標(biāo)序列甘蔗條紋花葉病信息參見(jiàn)附錄

,。A。

4儀器與設(shè)備

41實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀激發(fā)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍可用熒光染料和水

.PCR:/350nm~750nm;(SYBRGreenI)

解型寡核苷酸探針探針升降溫速度均一性準(zhǔn)確性溫

(TaqMan);≥2.0℃/s;+/-0.5℃;+/-0.3

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