六、水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展脊椎動(dòng)物無(wú)脊椎動(dòng)物魚(yú)類(lèi)多孔動(dòng)物門(mén)棘皮動(dòng)物門(mén)腔腸動(dòng)物門(mén)節(jié)肢動(dòng)物門(mén)軟體動(dòng)物門(mén)1、魚(yú)類(lèi)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)所取材的組織器官來(lái)源很多，包括性腺、腎臟、肝臟、脾臟、心臟、鰭條、鰾、鰓上皮、皮膚、吻端、內(nèi)分泌組織、血液、肌肉組織以及骨骼細(xì)胞。魚(yú)類(lèi)胚胎和幼魚(yú)的各種組織，分化程度低，分裂潛能大，病毒攜帶少，適合作為原代培養(yǎng)的材料。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞平均傳代100代仍可以繼續(xù)分裂,比起哺乳類(lèi),分裂極限要大得多,并且每一代細(xì)胞的存活期均較長(zhǎng);人和哺乳動(dòng)物離體培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞株壽命一般不超過(guò)50代。至2010年,建立的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系約有275類(lèi)，其中大多數(shù)來(lái)自淡水魚(yú)或溯河產(chǎn)卵的海洋魚(yú)類(lèi)，約175株，分別來(lái)源于71個(gè)科的89種魚(yú)類(lèi)的不同組織；而海水魚(yú)類(lèi)及咸水魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞系約100株，分別來(lái)源于23個(gè)科的35種海水魚(yú)類(lèi)的不同組織。1981年我國(guó)建立了最早的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系——草魚(yú)吻端組織細(xì)胞系，至今已經(jīng)建立了70余種細(xì)胞株（系），來(lái)自40多種魚(yú)類(lèi)。來(lái)源的組織有吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、膘、性腺、肝臟、胚胎、囊胚、原腸胚、鰭條等。以淡水魚(yú)細(xì)胞培養(yǎng)為主。海水魚(yú)細(xì)胞的培養(yǎng)也越來(lái)越受到重視，如牙鲆鰓細(xì)胞系、鱸魚(yú)脾和心細(xì)胞系、真鯛鰭細(xì)胞系、花鱸胚胎干細(xì)胞系、漠斑牙鲆胚胎干細(xì)胞系、大菱鲆鰭細(xì)胞系、點(diǎn)帶石斑魚(yú)脾臟細(xì)胞系等。1976年建立了世界上第一個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，虹鱒魚(yú)生殖腺細(xì)胞系：RTG-2。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,已由單純的病毒培養(yǎng)分離、免疫學(xué)、毒理學(xué)、致癌作用、遺傳學(xué)研究逐步向近些年研究很集中的基因組學(xué)、DNA的復(fù)制與修飾、表觀遺傳學(xué)、基因敲除、RNAi以及最新的iPS等各個(gè)方面發(fā)展。2、節(jié)肢動(dòng)物已經(jīng)對(duì)龍蝦、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、草蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦等多種蝦類(lèi)進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)研究。但由于其生理、生化特點(diǎn)以及生活環(huán)境均與陸生動(dòng)物有很大差異，加之其細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要和代謝機(jī)理研究滯后，因而，節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞系的建立問(wèn)題至今仍是全世界所面臨的挑戰(zhàn)性課題。斑節(jié)對(duì)蝦淋巴器官的細(xì)胞在L-15培養(yǎng)基中傳了90代，第90代后細(xì)胞不能繼續(xù)傳代生長(zhǎng)，只建立了有限細(xì)胞系。心臟、卵巢、鰓、胸腺、內(nèi)臟、肌肉、淋巴、肝胰臟等組織以及胚胎都被嘗試培養(yǎng)過(guò)。最易培養(yǎng)的組織依次是心臟、淋巴、卵巢、腦神經(jīng)節(jié)、眼球。待培養(yǎng)組織的消毒滅菌非常困難。節(jié)肢動(dòng)物的組織器官大多暴露于外界,帶有較多的微生物和寄生蟲(chóng),即使是健康個(gè)體體內(nèi)也存在一些微生物,使得培養(yǎng)易受污染而失敗。雖然蝦的胚胎和幼體應(yīng)是最易培養(yǎng)的材料,但是其胚胎和幼體是體外發(fā)育,受微生物污染嚴(yán)重,目前還沒(méi)有理想的消毒方法。鱟的鰓組織暴露在海水中，附有一層粘液，沖洗液很難除菌，鱟的血液中生活有許多的原生動(dòng)物，在培養(yǎng)鱟血細(xì)胞時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)原生動(dòng)物污染的現(xiàn)象。蝦類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用——病毒研究：桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV）、白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒奇怪的現(xiàn)象：蝦蟹類(lèi)在春季、秋季細(xì)胞培養(yǎng)較難，冬季幾乎不能成功。這可能與其體內(nèi)的激素分泌和細(xì)胞的基因調(diào)控有關(guān)。軟體動(dòng)物的數(shù)量?jī)H次于節(jié)肢動(dòng)物,為動(dòng)物界中第二大類(lèi)群,包括各種螺類(lèi)、雙殼類(lèi)、烏賊和章魚(yú)等。軟體動(dòng)物是細(xì)胞培養(yǎng)研究開(kāi)展得最多的一類(lèi)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。3、軟體動(dòng)物門(mén)軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)象主要是一些養(yǎng)殖的雙殼類(lèi)和腹足類(lèi),包括貽貝、珍珠貝、牡蠣、蛤蜊、螺和鮑等。所培養(yǎng)的組織細(xì)胞主要來(lái)源于胚胎、鰓、外套膜、神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、消化腺和心肌等。19世紀(jì)70年代,軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就已取得了一些進(jìn)展。在珍珠牡蠣外套膜組織培養(yǎng)中,成功觀察到了體外培養(yǎng)的外套膜細(xì)胞能夠分泌有機(jī)物和進(jìn)行有絲分裂的現(xiàn)象。但隨后的珍珠牡蠣的外套膜組織培養(yǎng)卻一直沒(méi)有很大的進(jìn)展。1976年,建立起了第一個(gè)也是迄今為止唯一一個(gè)軟體動(dòng)物細(xì)胞系:淡水蝸牛擔(dān)輪幼蟲(chóng)胚胎細(xì)胞系BGE。至今沒(méi)有解決海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞的體外長(zhǎng)期存活和成功傳代建系的問(wèn)題,即使是培養(yǎng)貝類(lèi)的腫瘤組織也不例外。近年來(lái),海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)物的應(yīng)用研究開(kāi)始增多。利用巨牡蠣的血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)外源污染物的毒性效應(yīng)。貝類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)Ⅱ：無(wú)脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，血液是重要的免疫器官。細(xì)胞培養(yǎng)作為良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅＿m用于血細(xì)胞對(duì)外毒物的反應(yīng)的研究Ⅰ：外套膜細(xì)胞培養(yǎng)。主要有：馬氏珠母貝、櫛孔扇貝、鮑、文蛤、大珠母貝Ⅲ：鰓細(xì)胞的培養(yǎng)。①利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細(xì)胞探究了血細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖的刺激下免疫相關(guān)基因CfToll-1表達(dá)量的變化情況；研究苯并芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞的影響。②利用多種病原相關(guān)分子模式刺激培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣原代血細(xì)胞來(lái)研究相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化情況。③利用僧帽牡蠣的鰓組織進(jìn)行了培養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上研究了毒性較大的氯化三丁基錫對(duì)牡蠣鰓組織細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)以及存活率的影響。貝類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)面臨的主要困難（2）在添加促生長(zhǎng)因子方面，一直沒(méi)能尋得一種或是幾種混合的生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)貝類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。不能單純的套用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)模式，必須要充分的認(rèn)識(shí)海洋貝類(lèi)動(dòng)物的不同，深入研究貝類(lèi)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝以及細(xì)胞生理等，以便研發(fā)海洋貝類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)所適用的培養(yǎng)基；（3）貝類(lèi)開(kāi)放的生活環(huán)境，器官組織攜帶大量病菌。（1）在體外使貝類(lèi)細(xì)胞無(wú)限增殖仍然是全世界所面臨的難題。目前對(duì)于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物特別是貝類(lèi)細(xì)胞增殖和調(diào)控的知識(shí)知之甚少；由于海綿特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn),使得海綿細(xì)胞培養(yǎng)面臨很大困難,進(jìn)展緩慢,仍停留在原代培養(yǎng)水平。主要有以下兩個(gè)原因:(1)海綿動(dòng)物多為合胞體，即整個(gè)生物體是由一個(gè)巨大的內(nèi)有橫隔片的多核細(xì)胞構(gòu)成，通過(guò)胞內(nèi)隔片上的孔道來(lái)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)交換。分散培養(yǎng)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中很難存活和分裂。體外培養(yǎng)的海綿細(xì)胞相互接觸后,會(huì)彼此融合,形成一個(gè)大的多核體,結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有著很大的不同；2)海綿動(dòng)物體內(nèi)存在著多種內(nèi)共生的微生物,難以實(shí)現(xiàn)海綿細(xì)胞的無(wú)菌培養(yǎng)。如果不使用抗生素的話,培養(yǎng)又只能維持1~3天。4、多孔動(dòng)物（海綿動(dòng)物）細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。體外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)有著很?chē)?yán)格的要求。在培養(yǎng)時(shí),多數(shù)腔腸動(dòng)物細(xì)胞都只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能存活,而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上,才能很好地貼壁、鋪展和遷移。腔腸動(dòng)物門(mén)包括珊瑚、海葵等,是二胚層多細(xì)胞后生動(dòng)物,有了組織的分化,但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中膠層構(gòu)成,細(xì)胞類(lèi)型少。5、腔腸動(dòng)物細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。體外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)有著很?chē)?yán)格的要求。在培養(yǎng)時(shí),多數(shù)腔腸動(dòng)物細(xì)胞都只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能存活,而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上,才能很好地貼壁、鋪展和遷移。腔腸動(dòng)物門(mén)包括珊瑚、?？?是二胚層多細(xì)胞后生動(dòng)物,有了組織的分化,但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中膠層構(gòu)成,細(xì)胞類(lèi)型少。5、腔腸動(dòng)物水螅剖面圖棘皮動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)研究開(kāi)展得很少,雖然棘皮動(dòng)物具有無(wú)與倫比的再生能力,如海星臂的再生和海參的吐臟再生等。但是其細(xì)胞培養(yǎng)還是難獲成功,目前仍然停留在原代培養(yǎng)的水平上。6、棘皮動(dòng)物海參吐臟最早在1993年開(kāi)始了對(duì)海參再生組織的細(xì)胞培養(yǎng),至40天時(shí),觀察到再生腸組織來(lái)源的細(xì)胞團(tuán)發(fā)生旋轉(zhuǎn)和再生呼吸樹(shù)來(lái)源的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)搏動(dòng)現(xiàn)象。最近,對(duì)海參吐臟后不同再生階段的腸組織進(jìn)行了原代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)只有吐臟后第14～16天的再生腸組織的原代培養(yǎng)物中,能觀察到活躍的細(xì)胞增殖,細(xì)胞的數(shù)量于培養(yǎng)后第20天加倍,而在其他再生階段的腸組織原代培養(yǎng)物中均未觀察到細(xì)胞分裂現(xiàn)象。第五節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)用1用細(xì)胞生產(chǎn)珍珠珍珠的價(jià)值中國(guó)海水珍珠年產(chǎn)量20余噸；淡水珠產(chǎn)量1500余噸,占世界的95％以上,但能作為高檔工藝珠的不足1%。與生產(chǎn)工藝有關(guān)年需求量約1000噸，出口量達(dá)400噸

觀賞收藏藥用保健藥用珍珠珍珠粉為類(lèi)白色的極細(xì)粉，氣微，味淡。4%4%91%0.4%牛磺酸維生素藥用、化妝品、中成藥的主要原料（六神丸、安宮牛黃丸等），安神、平肝息風(fēng)。天然海水珍珠淡水養(yǎng)珠蚌科

三角帆蚌

（珠質(zhì)細(xì)膩、光滑、色澤鮮艷、較圓，質(zhì)量最佳，但成珠慢）

褶紋冠蚌

（珍珠長(zhǎng)圓形，白色或粉紅色；成珠快，產(chǎn)量高）

珍珠的主要來(lái)源珍珠貝科

馬氏珍珠貝，又稱(chēng)南珠，粒大、圓潤(rùn)、光彩迷人,為國(guó)之瑰寶）馬氏珍珠貝又稱(chēng)合浦珠母貝。貝殼斜四方形，背緣略平直，腹緣弧形，前、后緣弓狀。前耳突出，近三角形；后耳較粗短。中國(guó)分布在廣西、廣東和臺(tái)灣海峽南部沿海一帶。國(guó)際上公認(rèn)中國(guó)出產(chǎn)的南海珍珠的質(zhì)量在世界上首屈一指。珍珠的形成機(jī)理軟體動(dòng)物和腕足動(dòng)物殼內(nèi)的體壁褶。珍珠的形成機(jī)理珍珠的形成機(jī)理外套膜海水珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)傳統(tǒng)的珍珠生產(chǎn)超大型淡水珍珠養(yǎng)殖吊養(yǎng)場(chǎng)采收珍珠視頻資料利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)珍珠目的：培養(yǎng)直徑8mm以上、光澤度好的正圓珍珠實(shí)驗(yàn)材料：（1）選取體質(zhì)健康、大小均一的1齡三角帆蚌用作細(xì)胞培養(yǎng)，3齡的三角帆蚌為插核之用。（2）細(xì)胞培養(yǎng)材料：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰酶、10000IU雙抗(青、鏈霉素)、?；撬帷⒖箟难?、水解乳蛋白、制霉菌素、多聚賴氨酸（1）外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)的過(guò)程（2）細(xì)胞活性與貼壁效果的檢測(cè)（3）珠核的預(yù)處理臺(tái)盼藍(lán)染色法顯微鏡觀察法1齡小蚌，切斷前后閉殼肌，撕膜法分離出外套膜外表皮，剪碎，胰酶消化洗滌、高壓滅菌處理（5）內(nèi)臟團(tuán)插核手術(shù)（為什么選擇？）（6）垂直吊養(yǎng)（4）共培養(yǎng)嚴(yán)格消毒后，用通道針在內(nèi)臟團(tuán)與斧足交界處開(kāi)口，并制造通道，深度為2cm，口徑為1cm，將處理后的珠核移植到育珠蚌體內(nèi)，吸取0.5mL外套膜細(xì)胞懸液，注射到珠核周?chē)?。用浸泡在雙抗中的一次性棉棒擦拭傷口，按壓以促進(jìn)傷口消炎愈合。珠核放入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中，完全淹沒(méi)珠核。吊養(yǎng)位置為水面下25cm處，進(jìn)行常規(guī)育珠養(yǎng)殖。由于外套膜比較薄，容易插破，不適宜插大核來(lái)培育大顆粒的珍珠。相比之下內(nèi)臟團(tuán)分布空間很大，且具有珍珠生物礦化所需的生化條件。應(yīng)用2魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)

用細(xì)胞分離、檢測(cè)鑒別病毒什么是病毒？視頻資料病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害迄今已發(fā)現(xiàn)的近60種魚(yú)類(lèi)病毒。其中有9種病毒對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)有嚴(yán)重的影響,它們是:①雙RNA病毒科的傳染性胰壞死病毒②虹彩病毒科的虹彩病毒③棒狀病毒科的雙鏈DNA棒狀病毒④呼腸病毒科的草魚(yú)呼腸病毒⑤野田病毒科的野田病毒⑥彈狀病毒科的鯉魚(yú)春季病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和白斑狗魚(yú)幼魚(yú)彈狀病毒。傳染性胰壞死病毒：10～12℃死亡率可高達(dá)80～100%。胰腺壞死，胰腺泡、胰島及所有的細(xì)胞幾乎都發(fā)生異常，多數(shù)細(xì)胞壞死，核固縮、核碎裂十分顯著。病魚(yú)游動(dòng)失調(diào)，常作垂直回轉(zhuǎn)游動(dòng)，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重復(fù)以上游動(dòng)，直至死亡。虹彩病毒：死亡率從30%(成魚(yú)階段)到100%(幼苗階段)不等。感染的硬骨魚(yú)類(lèi)包括鱸形目、鰈形目、鱈形目和鲀形目等4目近百種海水、淡水魚(yú)類(lèi)。出血性敗血癥病毒：許多鮭鱒魚(yú)對(duì)其敏感。傳染性強(qiáng)，死亡率可達(dá)80%。有急性型(體黑、眼突出，肌肉、脂肪組織、口腔和鰾出血，死亡率高，常見(jiàn)初期)、慢性型(動(dòng)作遲緩，貧血，低死亡率，常見(jiàn)中期)和神經(jīng)型(運(yùn)動(dòng)失調(diào)，螺旋狀旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，緩慢死亡，流行末期)3種類(lèi)型目前無(wú)有效治療方法。病毒感染環(huán)境因素免疫系統(tǒng)蝦類(lèi)病毒：桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV）、白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒。在體外原代培養(yǎng)的斑節(jié)對(duì)蝦類(lèi)淋巴細(xì)胞中進(jìn)行了斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)和黃頭病毒的增殖,獲得成功。用凡納濱對(duì)蝦類(lèi)淋巴原代細(xì)胞接種黃頭病毒(YHV),出現(xiàn)了CPE。致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE）：指病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。具體而言，體外組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，溶細(xì)胞病毒在易感細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制增殖導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等現(xiàn)象，稱(chēng)為致細(xì)胞病變效應(yīng)。致細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒斜帶石斑魚(yú)的腦組織細(xì)胞系GBC1和GBC4并用于病毒敏感性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)前者對(duì)于神經(jīng)壞死病毒(GNNV)高度敏感,但對(duì)于花鱸虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的結(jié)果正好相反。玳瑁石斑魚(yú)腦、鰓、心臟3個(gè)細(xì)胞系,進(jìn)行了病毒及細(xì)胞毒素敏感性的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞系對(duì)于不同病毒和毒素的敏感性存在明顯的差異。病毒對(duì)細(xì)胞具有選擇性病毒的培養(yǎng)分離實(shí)例-----魚(yú)源彈狀病毒的分離魚(yú)類(lèi)彈狀病毒是一類(lèi)能使多種魚(yú)出現(xiàn)高致死率的病毒病原體，其感染宿主譜廣、普遍存在、嚴(yán)重危害各種淡水和海水魚(yú)。迄今報(bào)道感染魚(yú)類(lèi)的彈狀病毒已有20多種，包括導(dǎo)致鯉科魚(yú)類(lèi)大規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥的鯉春病毒血癥病毒、引起虹鱒、鮭等患出血性疾病的病毒性出血性敗血癥病毒、引起鱒魚(yú)和太平洋大馬哈魚(yú)為主的急性、全身性的嚴(yán)重傳染病的傳染性造血器官壞死病毒、以及牙鲆彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒、鱖魚(yú)彈狀病毒、胭脂魚(yú)彈狀病毒、石鰈魚(yú)彈狀病毒等。草魚(yú)腎細(xì)胞系(CIK)肥頭鯉細(xì)胞系(FHM)鯉上皮細(xì)胞系(EPC)草魚(yú)腦細(xì)胞(CIB)草魚(yú)鰾細(xì)胞(GSB)錦鯉吻端細(xì)胞系(KPC)劍尾魚(yú)胚胎細(xì)胞系(SFC)鱖腦細(xì)胞系(SCC)所用細(xì)胞系及代號(hào)無(wú)菌采取病魚(yú)的鰾、肝、腎、脾，加入含雙抗的滅菌的PBS中制成1∶1的勻漿液，在－20℃凍融3次后，組織勻漿液依次經(jīng)2000、5000和10000r/min，每次離心10min，去沉淀，上清液經(jīng)濾膜孔徑為0.22μm的微孔濾器過(guò)濾除菌分別接種密度為80%~90%的單層FHM、EPC、CIK、GIB、GSB、KPC、SFC和SCC細(xì)胞，室溫下吸附1h，吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液(含3%FBS的M199)，28℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)。病毒傳代時(shí)，將病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2～3次。如何檢測(cè)鑒別病毒？直接檢測(cè)免疫檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)1、電子顯微鏡；2、病毒包涵體檢查1、酶免疫技術(shù)；2、熒光免疫技術(shù)3、單克隆抗體技術(shù)1、核酸雜交；2、PCR、RT-PCR技術(shù)；一、電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)研究病毒形態(tài)、鑒定診斷病毒病

檢測(cè)不能在體外培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒、星狀病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的——能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。彈狀病毒的電子顯微鏡觀察標(biāo)本的制備濃縮標(biāo)本方法：①超速離心離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是30min到3h．沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；②超過(guò)濾法用于分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為10000；③接種細(xì)胞接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；④免疫凝集如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒1、正染法（超薄切片法、病組織）將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常1~2d完成。操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長(zhǎng)期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過(guò)程。2、負(fù)染法直接將病毒懸液(也可用細(xì)胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果。原理：負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周?chē)当尘吧巷@示亮區(qū)——較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術(shù)采用幾種電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài)Orfvirus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技術(shù)）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技術(shù)）負(fù)染技術(shù)彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)狀態(tài)二、病毒的免疫檢測(cè)1、熒光免疫法(IF)2、酶免疫法（ELISA）3、單克隆抗體技術(shù)1、免疫熒光法(IF)熒光（fluorescence）熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱(chēng)為熒光。

熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光物質(zhì)：一類(lèi)能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。

電子的躍遷熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標(biāo)記抗體與切片中組織細(xì)胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定?？贵w要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

熒光抗體的制備有能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求抗體的熒光素標(biāo)記標(biāo)記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標(biāo)記方法:

攪拌法：適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。

透析法：適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標(biāo)記比較勻，非特異染色較低。去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過(guò)濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過(guò)度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動(dòng)物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光抗體的純化直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。熒光抗體染色間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光顯微鏡利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：

免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶促催化反應(yīng)的高敏感性2、酶免疫法（ELISA）特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析

酶免疫技術(shù)的核心部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相異相固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片中的抗原抗體反應(yīng)

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量(ELISA)三個(gè)部分：免疫反應(yīng)酶與底物反應(yīng)檢測(cè)方法的建立ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高純度的抗原、高親和力的抗體高活性、高純度的標(biāo)記用酶有效的交聯(lián)方法制備高質(zhì)量的酶標(biāo)記物選用適宜的酶/底物系統(tǒng)底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物

酶反應(yīng)的底物

雙抗體夾心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清病毒樣品，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。ELISA檢測(cè)抗原的方法1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包2、加待檢物無(wú)抗3、加酶標(biāo)抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY陰性對(duì)照洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合，加底物不顯色（一）固相載體聚苯乙烯特點(diǎn)：吸附蛋白能力強(qiáng)，保留其免疫活性形狀：小試管、小珠、微量ELISA板

（二）抗原和抗體高純度的抗原高效價(jià)的抗體固相酶免疫測(cè)定的技術(shù)要點(diǎn)

（三）酶和底物的選擇標(biāo)記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專(zhuān)一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉辣根過(guò)氧化物酶(HRP)糖蛋白HRP的常見(jiàn)底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTSOPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。堿性磷酸酶（ALP）菌源性ALP腸粘膜ALPβ-半乳糖苷酶（β-Gal）其他的酶大腸埃希氏菌

ALP的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)ALP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

β-Gal的底物

4-甲基傘酮基β-D-半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量?？乖蠹兌雀?，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

酶標(biāo)抗體制備方法要求制備方法過(guò)碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一純化標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度

抗體是從何來(lái)的？傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法及缺陷是什么？

抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。3、單克隆抗體技術(shù)

（１）B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。（２）動(dòng)物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬(wàn)種以上的抗體，每種抗體對(duì)特定的抗原具有特異性免疫作用。（３）每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。B淋巴細(xì)胞有什么特點(diǎn)？單克隆抗體的特點(diǎn)？

由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱(chēng)為單克隆抗體。

特異性強(qiáng)、靈敏度高

單克隆抗體制備過(guò)程？1、單克隆抗體：2、特點(diǎn)：?jiǎn)慰寺】贵w制備過(guò)程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體的應(yīng)用1、診斷試劑（病原微生物、腫瘤抗原檢測(cè)）2、蛋白質(zhì)提純3、腫瘤導(dǎo)向治療技術(shù)（生物導(dǎo)彈）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合

受精作用誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法用

誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程細(xì)胞核病毒顆粒滅活的病毒細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接雜種細(xì)胞融合細(xì)胞的篩選方法常用的克隆化培養(yǎng)方法1、半固體平板培養(yǎng)法2、有限稀釋法3、顯微鏡操作法4、蓋片分離法有限稀釋法樣品處理富集獲得病毒的核酸序列是描述病毒特征的關(guān)鍵。檢測(cè)分子生物學(xué)方法三、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)1、核酸雜交技術(shù)2、PCR和RT-PCR技術(shù)同源性：從分子水平講則是指兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。1、核酸雜交技術(shù)DNA的變性與復(fù)性DNA變性：DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)為復(fù)性。核酸雜交：DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，不管是整條鏈互補(bǔ)，還是部分序列互補(bǔ)，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，即為核酸分子雜交。瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH=2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。（2）DNA分子的構(gòu)象。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開(kāi)環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。（3）電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過(guò)5v/cm。（4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度，則電導(dǎo)率很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。溴化乙錠(Ethidiumbromide,EB)能插入DNA分子中形成復(fù)合物，在波長(zhǎng)為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對(duì)照，就可估算出待測(cè)樣品的濃度。Southern印跡雜交

使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由英國(guó)人EdwinMellorSouthern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫Southernblot。Southern雜交的主要步驟（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片利用非放射性探針檢測(cè)核苷酸Northern雜交*1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。也稱(chēng)為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測(cè)某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達(dá)量。*因這種方法與Southernblot雜交技術(shù)十分類(lèi)似，與DNA的雜交（Southern雜交）相對(duì)應(yīng)，被趣稱(chēng)為Northern雜交。Northern印跡雜交1、基本原理和基本過(guò)程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑(甲醛、尿素、甲酰胺等)保持RNA處于變性狀態(tài)。避免單鏈RNA自身形成高級(jí)結(jié)構(gòu)和自身降解

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理。原位雜交*細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)原位雜交過(guò)程：（1）組織或細(xì)胞的固定（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（3）探針的選擇與標(biāo)記探針的長(zhǎng)度一般為50~300bp

（4）雜交雜交溫度約為50℃（5）雜交結(jié)果檢測(cè)病毒性神經(jīng)壞死病毒病(viralnervousnecrosis,VNN)是石斑魚(yú)育苗過(guò)程的重大病害之一,該病原體為二十面體,無(wú)囊膜,直徑25~30nm的RNA病毒,屬于諾達(dá)病毒科。發(fā)病癥狀為魚(yú)不正常游動(dòng),魚(yú)鰾脹氣腫大,體色變深,厭食,可導(dǎo)致魚(yú)苗的大量死亡。致病性很強(qiáng),對(duì)石斑魚(yú)的養(yǎng)殖影響嚴(yán)重,一旦爆發(fā),難以控制。人工感染組織切片核酸探針的制備染色和原位雜交檢測(cè)用標(biāo)記有地高辛的426bp的病毒核酸片段與組織切片上病毒RNA進(jìn)行雜交。雜交陽(yáng)性物質(zhì)為紫褐色顆粒。BCIP/NBT紫藍(lán)色沉淀Dig（地高辛）抗Dig抗體堿性磷酸酶核酸分子雜交原理示意圖常用探針類(lèi)型

①人工合成寡核苷酸探針②基因組DNA探針③cDNA探針④RNA探針探針標(biāo)記物①放射性標(biāo)記物

32P高放射性半衰期14.3d

35S放射性較弱半衰期87.1d

3H放射性弱半衰期12.35a②非放射性標(biāo)記物

半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

理想探針標(biāo)記物應(yīng)具備的特性

高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性2、PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是目前比較快速、敏感、特異的檢測(cè)手段，已被廣泛應(yīng)用在病毒核酸檢測(cè)方面。

DNA的復(fù)制方向

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)。通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA序列得以迅速擴(kuò)增。PCR的原理PCR步驟：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93～94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合；耐熱的DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物的3’端開(kāi)始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。如此循環(huán)進(jìn)行，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106～107倍。PCR的結(jié)果---電泳圖反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR

RT-PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，它是以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA。這一過(guò)程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄，催化此過(guò)程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶。基本過(guò)程是以dNTP為底物，以RNA為模板，按5’→3’方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(cDNA)，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成，然后將DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用3疫苗的制備免疫系統(tǒng)與免疫應(yīng)答（一）抗原凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生抗體或致敏免疫活性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞），并能與之發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)“抗原”。具有上述2種特性的物質(zhì)稱(chēng)為完全抗原。（二）抗體抗體是由抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后產(chǎn)生，并能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。T淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞是胸腺依賴性淋巴細(xì)胞的簡(jiǎn)稱(chēng)。由骨髓中多功能干細(xì)胞發(fā)育分化，并成熟于胸腺。它是一個(gè)復(fù)雜的群體，分為不同亞群。各亞群在形態(tài)學(xué)上并無(wú)明顯標(biāo)記，但不同亞群淋巴細(xì)胞分泌不同細(xì)胞因子。B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞在骨髓中分化成熟，故又稱(chēng)為骨髓衍生細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞在接受到APC傳遞的抗原信息后，在Th和巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用下，使B淋巴細(xì)胞活化，分化為成熟的漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，1個(gè)漿細(xì)胞每秒鐘能夠分泌超過(guò)2000個(gè)抗體分子。抗原免疫應(yīng)答什么是疫苗？疫苗是將病原微生物如細(xì)菌、病毒等及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。疫苗刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)某種病原微生物處于高度戒備狀態(tài)疫苗的發(fā)展歷史

①古典疫苗時(shí)期：牛痘苗、狂犬病疫苗

②培養(yǎng)疫苗時(shí)期：脊髓灰質(zhì)炎疫苗、卡介苗

③基因工程疫苗時(shí)期：乙型肝炎基因工程疫苗疫苗的種類(lèi)滅活疫苗弱毒疫苗基因工程疫苗重組亞單位疫苗DNA疫苗基因缺失疫苗基因突變疫苗活載體疫苗傳統(tǒng)疫苗成本低、無(wú)致病性、適用廣

滅活疫苗（inactivatedvaccine）：又稱(chēng)死疫苗，是用化學(xué)或物理的方法，將具有感染性的完整的病原微生物殺死，使其失去傳染性而保留抗原性而成。

一、滅活疫苗百日咳、乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、狂犬病、傷寒、鉤體病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰質(zhì)炎等疫苗。二、減毒活疫苗（弱毒疫苗）減毒活疫苗（live-attenuatedvaccine）：用人工誘變或從自然界篩選出的毒力高度降低或無(wú)毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模擬自然發(fā)生隱性感染，誘發(fā)理想的免疫應(yīng)答而又不產(chǎn)生臨床癥狀。

脊髓灰質(zhì)炎、結(jié)核病、麻疹、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎等疫苗。

●優(yōu)點(diǎn)：能誘發(fā)全面、穩(wěn)定、持久的體液、細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答；一般只須接種一次；可采用口服、噴鼻或氣霧途徑免疫。

●缺點(diǎn)：有效期短和熱穩(wěn)定性差，運(yùn)輸、保存條件要求較高；回復(fù)突變危險(xiǎn)；使用范圍相對(duì)窄。

減毒活疫苗優(yōu)缺點(diǎn)1、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）：采用分子生物學(xué)技術(shù)，去除與毒力或毒力相關(guān)基因片段，使病原微生物毒力減低或喪失。用缺失突變毒株制成的疫苗。與自然突變株（多為點(diǎn)突變毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易發(fā)生毒力返祖的優(yōu)點(diǎn)。

三、基因工程疫苗對(duì)于某些抗原性弱、易發(fā)生免疫逃避的病原體，常規(guī)疫苗往往難以獲得有效的免疫應(yīng)答及保護(hù)性。2、亞單位疫苗對(duì)于一些免疫保護(hù)機(jī)制不清、可能誘導(dǎo)免疫病理反應(yīng)、有潛在致腫瘤作用的病毒，以及不易培養(yǎng)的病原體，則難以用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)疫苗。

亞單位疫苗：亞單位疫苗是應(yīng)用某些化學(xué)試劑裂解細(xì)菌或病毒,驅(qū)除病原微生物中有害成分和無(wú)用的成分,保留其中一種或幾種主要抗原成分的一類(lèi)疫苗。不含病原體核酸，選用能誘發(fā)宿主產(chǎn)生中和抗體的微生物蛋白或表面抗原而制成。

●白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素

●流感嗜血桿菌莢膜多糖、腦膜炎球菌莢膜多糖

●流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶

●人乳頭瘤病毒

優(yōu)點(diǎn)：除去了病原體中與誘發(fā)保護(hù)性免疫無(wú)關(guān)或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明顯增強(qiáng)而穩(wěn)定，可靠性提高，對(duì)機(jī)體引起的不良反應(yīng)小。

缺點(diǎn)：需要選用佐劑；不能誘發(fā)細(xì)胞免疫和黏膜免疫。

將病原體中能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的目的抗原編碼基因克隆后，插入適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧吮磉_(dá)載體質(zhì)粒；

再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)目的基因；

分離、提取、純化目的蛋白而制成。

基因重組亞單位疫苗

(geneticengineeringsubunit

vaccine)活載體疫苗：又稱(chēng)重組載體疫苗，是將有效的目的抗原的編碼基因?qū)牖钶d體（無(wú)或弱毒的細(xì)菌或病毒株）中，構(gòu)建重組菌株；目的基因可隨重組菌株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達(dá)，從而誘發(fā)相應(yīng)的免疫保護(hù)作用。

3、活載體疫苗載體：腺病毒、牛痘病毒、金絲雀痘病毒、傷寒沙門(mén)菌減毒株、卡介苗、乳桿菌、枯草芽孢桿菌芽孢等。

病原體：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾桿菌等。活載體疫苗：又稱(chēng)重組載體疫苗，是將有效的目的抗原的編碼基因?qū)牖钶d體（無(wú)或弱毒的細(xì)菌或病毒株）中，構(gòu)建重組菌株；目的基因可隨重組菌株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達(dá)，從而誘發(fā)相應(yīng)的免疫保護(hù)作用。

3、活載體疫苗載體：腺病毒、牛痘病毒、金絲雀痘病毒、傷寒沙門(mén)菌減毒株、卡介苗、乳桿菌、枯草芽孢桿菌等。

病原體：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾桿菌等。將白斑綜合征病毒Vp26基因與枯草芽孢桿菌的衣殼蛋白CotC基因融合，從而將Vp6蛋白展示在芽孢表面制成口服疫苗。該疫苗包被飼料免疫南美對(duì)蝦后能夠起到100％的免疫保護(hù)作用。1990年，Wolf等首次發(fā)現(xiàn)，給小鼠肌肉注射裸露質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒攜帶的基因可被肌細(xì)胞攝取并在其中表達(dá)，還可誘生特異性免疫應(yīng)答。

4、核酸疫苗核酸疫苗具有構(gòu)建容易、生產(chǎn)方便、表達(dá)穩(wěn)定及可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答等特點(diǎn)，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，被譽(yù)為疫苗的“第三次革命”。

核酸疫苗：又稱(chēng)DNA疫苗（基因疫苗），是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上；再將重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。

目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)的有HIVDNA疫苗和瘧疾DNA疫苗和流感DNA疫苗。

免疫機(jī)制：局部注射的核酸（重組質(zhì)粒DNA）被周?chē)募?xì)胞（如黏膜上皮細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞）攝取后，進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并在胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白。

目的蛋白被蛋白酶復(fù)合體降解成含有表位的抗原肽，可作為：

●“內(nèi)源性抗原”：與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合，誘發(fā)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

●“外源性抗原”：與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合，誘發(fā)偏向Th1型免疫應(yīng)答。目的蛋白亦可通過(guò)細(xì)胞分泌或細(xì)胞破裂的方式進(jìn)入組織間，以天然折疊形式激活B淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生抗體。DNA疫苗接種后，體內(nèi)僅表達(dá)pg～ng水平的外源蛋白，但能誘發(fā)強(qiáng)而持久的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。核酸疫苗的構(gòu)建與免疫

①目的基因的選擇：側(cè)重于免疫原性，即所表達(dá)的目的蛋白刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T細(xì)胞抗原表位，是保證核酸免疫有效的先決條件。

核酸疫苗所選擇的目的基因應(yīng)盡量避免有害基因成分，特別是病毒或腫瘤的核酸免疫。

②載體的選擇：構(gòu)建DNA疫苗的質(zhì)粒通常是非復(fù)制型的真核表達(dá)質(zhì)粒，能高水平地表達(dá)目的基因。

重組質(zhì)粒可分為兩個(gè)部分：

●

轉(zhuǎn)錄部分：由啟動(dòng)子、插入的目的抗原cDNA和polyA終止子組成，指導(dǎo)目的蛋白在體內(nèi)表達(dá)，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。

●

佐劑部分：CpG基序。③啟動(dòng)子的選擇：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源性蛋白的水平與調(diào)控DNA表達(dá)的啟動(dòng)子關(guān)系密切。表達(dá)水平的不同又直接影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)性。

核酸疫苗與傳統(tǒng)疫苗的比較傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒的活病原體或病原體的亞單位蛋白。

核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，