海洋生物技術(shù)第六章海產(chǎn)藍(lán)藻基因工程一、藍(lán)藻簡介與分類藍(lán)藻是原核生物，又叫藍(lán)綠藻藍(lán)細(xì)菌；大多數(shù)藍(lán)藻的細(xì)胞壁外面有膠質(zhì)衣，因此又叫粘藻。在全部藻類生物中，藍(lán)藻是最簡潔、最原始的一種。藍(lán)藻是單細(xì)胞生物，沒有細(xì)胞核，但細(xì)胞中心含有核物質(zhì)，通常呈顆粒狀或網(wǎng)狀，染色質(zhì)和色素均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)中。該核物質(zhì)沒有核膜和核仁，但具有核的功能，故稱其為原核(或擬核)。在藍(lán)藻中還有一種環(huán)狀DNA——質(zhì)粒，在基因工程中擔(dān)當(dāng)了運(yùn)載體的作用。和細(xì)菌一樣，藍(lán)藻屬于“原核生物”。藍(lán)藻屬藍(lán)藻門分為兩綱：色球藻綱和藻殖段綱。色球藻綱藻體為單細(xì)胞體或群體；藻殖段綱藻體為絲狀體，有藻殖段。35~332023900分布格外廣泛，普及世界各地，但大多數(shù)(約75%)淡水產(chǎn)，少數(shù)海產(chǎn)。在我國三亞灣海疆，主要以來自外海的外源性海洋藍(lán)藻束毛藻為主要優(yōu)勢(shì)群落,其次有共生藍(lán)藻胞內(nèi)植生藻Richeliaintracelluulari胞藍(lán)藻集胞藻屬Synechocyti。在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中,藍(lán)藻呈多樣性分布,AnabaenaNotocCatothri顫藻屬OcillatoriaLyngbya。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中藍(lán)藻主要以顫藻為主要優(yōu)勢(shì)種,其次是鞘絲藻也占重要的比例。海洋近岸微型海藻墊中,有些群落主要以顫藻屬和鞘絲藻屬為主,有些微藻墊以眉藻屬為主要優(yōu)勢(shì)屬種,藍(lán)藻種群隨季節(jié)的變化有明顯的演替。1.2.3.4.5.550,60,70,80和大分子技術(shù),901.從鈍頂螺旋藻中克隆了海帶基因工程育種的目的基因,并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物較自然蛋白具有顯著的抑制腫瘤、延長生命及促進(jìn)免疫系統(tǒng)活性作用。2.從鈍頂螺旋藻中首次分別到質(zhì)粒,有證據(jù)說明質(zhì)粒與形態(tài)有肯定關(guān)系,該結(jié)果發(fā)表后國內(nèi)外很多單位索要單行本。正在構(gòu)建細(xì)菌-螺旋藻重組載體。3.從我國特產(chǎn)的紅藻-真江籬中分別到質(zhì)粒,正在爭論其功能和構(gòu)建重組載體。4.確定了CaMV35S裙帶菜外植體,已獲得GUS了制備鈍頂螺旋藻透性體、形成克隆和遺傳篩選的方法,為遺傳轉(zhuǎn)化奠定了根底。爭論了海帶和螺旋藻遺傳選擇標(biāo)記。5.6.三、海產(chǎn)藍(lán)藻構(gòu)造基因組爭論(一)原綠球藻基因組爭論1.海洋單細(xì)胞藍(lán)藻0.5~0.7μm,廣泛分布于熱帶和亞熱帶海疆。2.目前,完成序列測(cè)定工作的原綠球藻共3ProchlorococcumarinuSS120,ProchlorococcumarinuMIT9313,ProchlorococcumarinuMED41.聚球藻(Synechococcup.)是一臨時(shí)的分類單位,包括球狀和桿狀藍(lán)藻,它主要限定于包含葉綠素a1和藻膽體構(gòu)造的藍(lán)藻。目前正在進(jìn)展海洋聚球藻基PCC70022.和聚球藻WH8102WH8102NCBI出來。3.這些基因大多與聚球藻的運(yùn)動(dòng)性、糖轉(zhuǎn)移酶以及噬藍(lán)藻體相關(guān),此外,它還編碼了藻膽體基因簇和硝酸鹽復(fù)原酶相關(guān)基因,這些基因都與它區(qū)分于原綠球藻的獨(dú)特生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。海產(chǎn)藍(lán)藻構(gòu)造基因組爭論海產(chǎn)藍(lán)藻構(gòu)造基因組爭論海產(chǎn)藍(lán)藻功能基因組爭論關(guān)于藍(lán)藻的基因序列數(shù)據(jù)涵蓋了諸如細(xì)胞分化、光合作用以及初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的相關(guān)基因。四、海產(chǎn)藍(lán)藻基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)常用兩種類型的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化自然轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、電擊穿孔和基因槍轉(zhuǎn)化。接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建穿梭載體再接合轉(zhuǎn)移。1、自然轉(zhuǎn)化(一)遺傳轉(zhuǎn)化藍(lán)藻作為基因工程受體系統(tǒng)，兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，其細(xì)胞構(gòu)造和遺傳特性與革蘭氏陰性細(xì)菌類似，局部種類的藍(lán)藻具有自然轉(zhuǎn)化和有效重組系統(tǒng)，在對(duì)數(shù)生長期不經(jīng)任何處理即可直接吸取外源DNA,因此，適用于大腸桿菌的各種分子生物學(xué)操作也同樣適用于某些具有自然感受態(tài)的不產(chǎn)生異型胞的單細(xì)胞藻類(王業(yè)勤等，1991)。1970S.PCC7943DNA(Shetakovetal.,1970)。藍(lán)藻自然轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍不清楚。優(yōu)缺點(diǎn)自然轉(zhuǎn)化在各類藍(lán)藻基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，具有操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但這類基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要適用于具有自然感受態(tài)且無異型胞分化的單細(xì)胞種類(秦松等，1994a),如聚球藻S.7943、6301、7942、7002S.6714、6803、6906(陳穎等，1999),因而適用范圍窄；選用自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來直接轉(zhuǎn)化外源DNA1995)。2、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化是指通過人工誘導(dǎo)感受態(tài)來引入外源DNA些藍(lán)藻不具有自然感受態(tài)，可以通過誘導(dǎo)的方法使其處于感受態(tài)，從而易于吸取外源基因。常用的誘導(dǎo)方法包括用Ca2+或EDTA等。閔紅濤等(1995)用溶菌酶處理聚球藻S.PCC6301pBR3255.010-5DNA5.010-4優(yōu)缺點(diǎn)相對(duì)于自然轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化可通過人工誘導(dǎo)感受態(tài)來擴(kuò)大其適應(yīng)范圍，就轉(zhuǎn)化效率而言，對(duì)同種藻株承受誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化要比用克隆的DNA自然轉(zhuǎn)化的效率高(閔紅濤等，1995),而且誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的重復(fù)性較好，但由于影響誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的因素較多，需要不斷摸索并改善影響轉(zhuǎn)化效率的相關(guān)條件，使之到達(dá)較高水平。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化主要適用于缺乏自然感受態(tài)的藍(lán)藻株系，如集胞藻S.6308。其它一些具有自然感受態(tài)的藍(lán)藻株系也可以通過S.6301、7002Verma(1990)報(bào)道，用溶菌酶處理念珠藻Notocmucorum形成的感受態(tài)也可提高其轉(zhuǎn)化效率。3、電擊轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化是借助外界電