第一章基因工程基因工程的基本原理基因工程的原理基因重組讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定和高效地表達基因工程的操作水平DNA分子水平

基因工程又叫做重組DNA技術或基因拼接技術。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀?；蚬こ痰暮诵臉嫿ㄖ亟MDNA2.基因工程的理論基礎一．基因工程的誕生1.誕生時間：20世紀70年代3.基因工程的技術保障限制性核酸內切酶DNA連接酶質粒載體DNA是生物遺傳物質的發(fā)現DNA雙螺旋結構的確立遺傳信息傳遞方式的認定為基因的分離和重組提供了必要的手段能將外源基因運送到細胞中

基因工程的基本內容

基因操作的工具限制性核酸內切酶DNA連接酶運載體2.目的基因與運載體結合4.篩選含有目的基因的受體細胞3.將重組DNA分子導入受體細胞1.提取目的基因5.目的基因的表達

基因操作基本步驟二.基因工程的工具1.限制性核酸內切酶能夠識別和切割DNA分子內一小段特殊核苷酸序列的酶來源④結果微生物（主要是細菌）形成粘性末端或平末端②作用部位：

③特點：專一性，即識別特定脫氧核苷酸序列，切割特定切點。磷酸二酯鍵什么叫粘性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫粘性末端。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個粘性末端？要切兩個切口，產生四個粘性末端。2.DNA連接酶將具有相同

的兩個DNA片段連接在一起。粘性末端遺傳與基因工程中幾種酶的比較1.限制性核酸內切酶2.DNA連接酶3.DNA解旋酶4.DNA聚合酶5.RNA聚合酶6.逆轉錄酶7.DNA酶8.TaqDNA聚合酶作用于DNA，使磷酸二酯鍵斷裂使DNA片段相連接，形成磷酸二酯鍵使DNA的氫鍵斷裂，DNA雙螺旋解開使脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵使DNA氫鍵斷裂，使核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵使脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵水解DNA，形成單個的脫氧核苷酸3.運載體——質粒質粒是能夠自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它在細菌中以獨立于擬核方式存在，是一種特殊的遺傳物質3.運載體——質粒基因工程的載體要滿足下列條件：在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存；具有多個限制酶切位點，以便與外源基因連接；具有標記基因，便于篩選；④對宿主細胞的生存不起決定性作用常見的標記基因有抗生素抗性基因、產生特定顏色的基因、熒光基因等。二.基因工程的工具3.運載體——質粒④質粒上有復制原點、

、

、

、

等結構。⑤除質粒外，

、

也可以作為基因工程的載體啟動子終止子標記基因控制質粒DNA轉移的基因λ噬菌體、植物病毒和動物病毒啟動子可與RNA聚合酶特異性結合而使轉錄開始的一段DNA序列終止子位于基因尾端的一段特殊DNA片段，它能阻止RNA聚合酶的移動，并使其從DNA分子上脫離下來，使轉錄終止控制質粒DNA轉移的基因質粒從一個細胞自我轉移到原來不存在這種質粒的另一個細胞中去。步驟一：獲得目的基因一、目的基因的序列為未知的：從基因文庫中獲取目的基因將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌中儲存，各受體菌分別含有這些生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚬こ痰牟僮鞑襟E建立基因文庫法獲取目的基因需要限制性核酸內切酶和DNA連接酶的參與二、目的基因的序列已知的：用化學方法合成目的基因用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增1、用化學方法合成目的基因①目的基因轉錄形成的mRNA通過逆轉錄合成單鏈DNA，再按堿基互補配對合成雙鏈DNA（目的基因）②根據蛋白質中氨基酸序列推測mRNA的堿基序列，再推測DNA堿基序列，最后通過DNA合成儀人工合成出目的基因。方法②可以得到幾種目的基因？原因是什么？蛋白質氨基酸序列推測mRNA的核苷酸序列推測結構基因的核苷酸序列化學合成目的基因步驟二.形成重組DNA常用相同的限制性核酸內切酶切割含目的基因DNA和質粒（載體DNA），以產生

。相同的粘性末端(2)用

連接兩個切口(即相同的粘性末端)，形成

分子DNA連接酶重組DNA實際操作中常用不同的限制酶切割含目的基因DNA和質粒以防止

和反向連接。自身環(huán)化幾個切口，幾個粘性末端？表達載體應包括：復制原點啟動子目的基因終止子標記基因轉錄的起點轉錄的終點步驟三、將重組DNA分子導入受體細胞受體細胞大腸桿菌枯草桿菌酵母菌動物細胞（通常是受精卵）氯化鈣感受態(tài)細胞法：用

處理細菌，可以增加細菌

的通透性，使重組質粒容易進入農桿菌轉化法、（基因槍法、花粉管通道法）植物細胞（受精卵、體細胞或原生質體）顯微注射法重組DNA導入受體細胞的方法細胞壁微生物作為受體細胞的優(yōu)點繁殖快多為單細胞遺傳物質相對較少農桿菌轉化法利用農桿菌易感染植物的特性，農桿菌質粒（Ti質粒）作為載體T-DNA農桿菌質粒上的一小段DNA，可使目的基因轉移至受體細胞的染色體DNA上，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，培養(yǎng)出轉基因植株。

（一）將目的基因導入植物細胞方法一：農桿菌轉化法

1.農桿菌轉化法并不適用所有的植物，主要適用于雙子葉植物2.受創(chuàng)傷的細胞能夠分泌一些酚類物質，用以吸引農桿菌3.農桿菌濃度不能過高，侵染時間不能過長，否則會導致植物冠癭瘤4.利用抗生素，完成脫菌過程（二）將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射技術通常選用動物的受精卵作為受體細胞。（三）將目的基因導入微生物細胞最常用的受體細胞為大腸桿菌，因為其繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。方法：感受態(tài)法用Ca2+（一般是用CaCl2溶液）處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA的感受態(tài)。選考真題：重組質粒進入農桿菌完成轉化實驗，在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床上培養(yǎng)一段時間，其目的是

使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態(tài)為提高重組DNA導入受體細胞的效率，除考慮導入方法、篩選條件、防止污染外，還需要考慮？重組DNA的質量和濃度、受體細胞的生長狀態(tài)和密度步驟四、篩選含有目的基因的受體細胞篩選原因：并不是所有的細胞都接納了

，因此，需篩選含

的受體細胞。篩選方法：用含

的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）培養(yǎng)受體細胞，選擇含

的受體細胞。重組DNA目的基因抗生素重組質粒怎樣進行檢測？舉例說明通過標記基因，進行篩選和檢測 目的基因在

中表達，產生人們需要的功能物質。步驟五、目的基因的表達宿主細胞利用DNA分子雜交技術，檢測目的基因是否導入宿主細胞利用核酸分子雜交技術，檢測目的基因是否轉錄利用抗原-抗體雜交技術，檢測目的基因是否表達④利用生物個體水平，檢測目的基因是否表達，生物是否具有相應性狀抗蟲抗病毒抗鹽堿抗低溫抗除草劑一些檢測方法：三.基因工程的應用1.基因工程與遺傳育種傳統(tǒng)育種的弊端：傳統(tǒng)的遺傳育種：雜交育種、誘變育種、單倍體育種、多倍體育種育種時間長，遠緣親本難以雜交周期短、目的性強、定向改造生物的遺傳性狀，克服遠緣雜交不親和的障礙基因工程育種：（1）轉基因植物（2）轉基因動物轉基因動物是指轉入了外源基因的動物。具有多種優(yōu)良遺傳性狀的轉基因鼠、牛、羊、豬、雞和魚已經問世?？茖W家正在研究培育能生產彩色羊毛的轉基因羊。優(yōu)點：

省時省力，并取得一定的經濟效益用轉基因動物生產藥物

乳腺生物反應器或乳房生物反應器：可以通過分泌的乳汁來生產所需要的藥品。作器官移植的供體2.基因工程與疾病治療⑴.基因工程藥物①胰島素大腸桿菌蛋白質②干擾素乙肝疫苗乙肝病毒表面抗原蛋白基因酵母細胞（工程菌）發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)分離純化表面抗原蛋白福爾馬林和AI（OH）3吸附是病毒侵入細胞后產生的糖蛋白，具有抗病毒、抗細胞分裂和免疫調節(jié)等多種生物學功能。是治療病毒性肝炎和腫瘤的藥物。（酵母菌）基因工程在醫(yī)藥工業(yè)和醫(yī)學領域的應用主要包括基因工程藥物和