普通光學顯微鏡的使用廣州生物醫(yī)藥技術職業(yè)學校溫錦泳概述現(xiàn)代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復式顯微鏡。它們由機械裝置和光學系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，對微生物學研究最為重要。

概述絕大多數(shù)細胞都很小，不能用肉眼觀察，要借助顯微鏡來觀察。顯微鏡的成象原理

光學顯微鏡是利用光學的成象原理，觀察標本結構的。首先利用反光鏡將可見光（自然光或燈光光源）反射到聚光器中，把光線會聚成束，穿過生物制片（樣品），進入到物鏡的透鏡上。因此所觀察的制片都要很?。ㄒ话銥?—10微米厚），光線才能夠穿透制片，經過物鏡將制片上的結構放大為倒的實象。這一倒的實象經過目鏡的放大，映入眼球內最后為放大的倒的虛象。顯微鏡的放大倍數(shù)

顯微鏡放大的倍數(shù)是由目鏡、物鏡和鏡筒的長度所決定。鏡筒長度一般為160毫米，常用的顯微鏡，物鏡與目鏡上都刻有放大倍數(shù)（一般目鏡越短，放大倍數(shù)越高；物鏡越長，放大倍數(shù)越高），如物鏡上刻有10×、20×、40×和90×等；目鏡上刻有5×、10×、15×和25×等。物體最后被放大的倍數(shù)為目鏡和物鏡二者放大倍數(shù)的乘積。顯微鏡的放大效能顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑決定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質折射率，顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。

顯微鏡的機械裝置

作用：固定與調節(jié)光學鏡頭，固定與移動標本等。主要由鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉換器、與調焦裝置組成。

鏡座和鏡臂1、鏡座：作用是支撐整個顯微鏡，裝有反光鏡，有的還裝有照明光源。2、鏡臂:作用是支撐鏡筒和載物臺。分固定、可傾斜兩種。載物臺又稱工作臺、鏡臺

載物臺作用：安放載玻片，形狀有圓形和方形兩種，其中方形的面積為120mm×110mm。中心有一個通光孔，通光孔后方左右兩側各有一個安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動式兩種。有的載物臺的縱橫坐標上都裝有游標尺，一般讀數(shù)為0.1mm，游標尺可用來測定標本的大小，也可用來對被檢部分做標記。

鏡筒鏡筒上端放置目鏡，下端連接物鏡轉換器。分為固定式和可調節(jié)式兩種。顯微鏡的機械筒長通常是160mm。安裝目鏡的鏡筒，有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種，雙筒則都是傾斜式的。其中雙筒顯微鏡，兩眼可同時觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調節(jié)，而且其中有一個目鏡有屈光度調節(jié)（即視力調節(jié)）裝置，便于兩眼視力不同的觀察者使用。

物鏡轉換器物鏡轉換器固定在鏡筒下端，有3—4個物鏡螺旋口，物鏡應按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉物鏡轉換器時，應用手指捏住旋轉碟旋轉，不要用手指推動物鏡，因時間長容易使光軸歪斜，使成像質量變壞。

調焦裝置顯微鏡上裝有粗準焦螺旋和細準焦螺旋。有的顯微鏡粗細準焦螺旋裝在同一軸上，大螺旋為粗準焦螺旋，小螺旋為細準焦螺旋；有的則分開安置，位于鏡臂的上端較大的一對螺旋為是粗準焦螺旋，其轉動一周，鏡筒上升或下降10mm。

位于粗準焦螺旋下方較小的一對螺旋為細準焦螺旋，其轉動一周，鏡筒升降值為0.1mm，細準焦螺旋調焦范圍不小于1.8mm。

顯微鏡的光學系統(tǒng)

物鏡目鏡聚光器

反光鏡

照明光源

濾光器

蓋玻片和載玻片

物鏡物鏡的分類：1

、根據使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡；其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用放大倍數(shù)為90—100倍）。

2、根據放大倍數(shù)的不同可分為

低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）、高倍物鏡（40—65倍）。

3、根據像差矯正情況，分為消色差物鏡（常用，能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡）和復色差物鏡（能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡，價格貴，使用少）。

物鏡物鏡的主要參數(shù)：

放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。

1、放大倍數(shù)：指眼睛看到像的大小與對應標本大小的比值。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。

2、數(shù)值孔徑也叫鏡口率，簡寫NA或A，是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨力成正比。

3、工作距離：指當所觀察的標本最清楚時物鏡的前端透鏡下面到標本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關，物鏡的焦距越長，放大倍數(shù)越低，其工作距離越長。物鏡物鏡的分辨力

分辨力也叫分辨率或分辨本領。分辨力的大小是用分辨距離（所能分辨開的兩個物點間的最小距離）的數(shù)值來表示的。顯微鏡的分辨距離越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。

顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來決定的，而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線的波長決定的。目鏡目鏡的結構

通常目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的透鏡叫做接目透鏡，下面的透鏡叫做會聚透鏡或場鏡。上下透鏡之間或場鏡下面裝有一個光闌（它的大小決定了視場的大?。?/p>

目鏡的長度越短，放大倍數(shù)越大（因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比）。

目鏡目鏡的作用

是將已被物鏡放大的，分辨清晰的實像進一步放大，達到人眼能容易分辨清楚的程度。

常用目鏡的放大倍數(shù)為5—16倍。

目鏡目鏡與物鏡的關系

物鏡已經分辨清楚的細微結構，假如沒有經過目鏡的再放大，達不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物鏡所不能分辨的細微結構，雖然經過高倍目鏡的再放大，也還是看不清楚，所以目鏡只能起放大作用，不會提高顯微鏡的分辨率。有時雖然物鏡能分辨開兩個靠得很近的物點，但由于這兩個物點的像的距離小于眼睛的分辨距離，還是無法看清。所以，目鏡和物鏡即相互聯(lián)系，又彼此制約。

聚光器

聚光器也叫集光器。位于標本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明視場聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗視場聚光鏡。

聚光器

聚光鏡的主要參數(shù)

數(shù)值孔徑（NA）是聚光鏡的主要參數(shù)，最大數(shù)值孔徑一般是1.2—1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通常刻在上方透鏡邊框上的數(shù)字是代表最大的數(shù)值孔徑，通過調節(jié)下部可變光闌的開放程度，可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑，以適應不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成，最上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路，使聚光鏡的數(shù)值孔徑變小，以適應低倍物鏡觀察時的照明。

聚光器

聚光鏡的作用

聚光鏡的作用相當于凸透鏡，起會聚光線的作用，以增強標本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點設計在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。（聚光焦點正在所要觀察的標本上，載玻片的厚度為1.1mm左右）

聚光器

可變光闌

可變光闌也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調節(jié)光強度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應。可變光闌開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察完畢后，應將光圈調至最大）。

在可變光闌下面，還有一個圓形的濾光片托架。

反光鏡反光鏡是一個可以隨意轉動的雙面鏡，直徑為50mm，一面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來的光線經通光孔反射上來。

反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。當用聚光器時一般用平面鏡，不用時用凹面鏡；當光線強時用平面鏡，弱時用凹面鏡。

觀察完畢后，應將反光鏡垂直放置。

照明光源顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源

。

1、天然光源

光線來自天空，最好是由白云反射來的。不可利用直接照來的太陽光。

2、人工光源

①、對人工光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強度；光源發(fā)熱不能過多。

②、常用的人工光源：顯微鏡燈；日光燈。濾光器安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過，而吸收掉其他的光線，即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強度。分為兩大類：濾光片和液體濾光器。

顯微鏡及其部件的使用

觀察前的準備

目鏡的使用低倍物鏡的使用高倍物鏡的使用油浸物鏡的使用

聚光器的使用

顯微鏡用畢后的處理

觀察前的準備1、顯微鏡的安置：置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊緣約3~4cm。鏡檢時姿勢要端正。

取、放顯微鏡時應一手握住鏡臂，一手托住底座，使顯微鏡保持直立、平穩(wěn)。切忌用單手拎提；且不論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應雙眼同時睜開觀察，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀察邊繪圖或記錄。觀察前的準備3、光源調節(jié)：安裝在鏡座內的光源燈可通過調節(jié)電壓以獲得適當?shù)恼彰髁炼?，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據光源的強度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或凸面反光鏡并調節(jié)其角度，使視野內的光線均勻，亮度適宜。

4、雙筒顯微鏡目鏡調節(jié)：雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當調節(jié)，而左(右)目鏡上一般還配有曲光度調節(jié)環(huán)，可以適應眼距不同或兩眼視力有差異的不同觀察者。觀察前的準備5、聚光器數(shù)值孔徑值的調節(jié)：調節(jié)聚光器虹彩光圈值與物鏡的數(shù)值孔徑值相符或略低。因為各物鏡的數(shù)值孔徑值不同，所以每轉換一次物鏡都應進行這種調節(jié)。

在聚光器的數(shù)值孔徑值確定后，若需改變光照強度，可通過升降聚光器或改變光源的亮度來實現(xiàn)，原則上不應再通過虹彩光圈的調節(jié)。當然，有關虹彩光圈、聚光器高度及照明光源強度的使用原則也不是固定不變的，只要能獲得良好的觀察效果，有時也可根據不同的具體情況靈活運用，不一定拘泥不變。目鏡的使用一般都是用一個放大倍數(shù)適中的目鏡（10×）和最低倍的物鏡開始觀察，逐步改用倍數(shù)較高的物鏡，從中找到符合實驗要求的放大倍數(shù)。低倍物鏡的使用先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標本片，轉動反光鏡，調好光線，從側面注視小心調節(jié)物鏡靠近標本，用粗調向上調至看到標本，再用細調對準焦距進行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。高倍物鏡的使用在低倍鏡下找到合適的觀察目標并將其移至視野中心后，輕輕轉動物鏡轉換器將高倍鏡移至工作位置。對聚光器光圈及視野亮度進行適當調節(jié)后微調細調節(jié)器使物像清晰，利用推進器移動標本仔細觀察并記錄所觀察到的結果。油浸物鏡的使用

在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側面注視，用粗調節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接。將聚光器升至最高位置并開足光圈，調節(jié)照明使視野亮度合適，用粗調節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細調節(jié)器使其清晰準焦為止。油浸物鏡的使用特別注意1、不要因在下降鏡頭時用力過猛，或調焦時誤將粗調節(jié)器向反方向轉動而損壞鏡頭及載玻片。2、使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動。聚光器的使用1、使用聚光器的原因

當放大倍數(shù)增加時，一方面由于放大倍數(shù)越高，透鏡數(shù)目越多，被透鏡吸收的光線也越多；另一方面由于視場（指的是所能看到被檢標本的范圍）的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比，即放大倍數(shù)越高，視場越暗。為了得到足夠的亮度，必須安裝聚光器，把光線集中到所要觀察的標本上。

聚光器的使用2、觀察時聚光器應處的高度

觀察時，要保證得到最好的觀察效果，聚光器的聚光焦點應正好落在標本上。要實現(xiàn)這個條件，就必須調節(jié)聚光器的高度。當用平行光照明時，聚光器的聚光焦點是在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm之處，因此，人們常常要求在觀察時將聚光器上升到它上端透鏡平面僅稍稍低于載物臺平面的高度，這樣聚光焦點就可能落到位于標準厚度載玻片上的標本上。聚光器的使用3、聚光器與物鏡的配合

所謂的配合，就是使聚光器和物鏡這兩者的數(shù)值孔徑取得一致，以更好的進行較為精細的觀察。聚光器與物鏡配合的操作方法是：在完成照明、調焦操作后，取下目鏡直接向鏡筒中看，把聚光器下的可變光闌關到最小，再慢慢地開大。開到它的口徑與所見視場的直徑恰好一樣大，然后按上目鏡，即可進行觀察。每轉換一次物鏡，都要隨著進行依次這樣的配合操作。有的聚光器可變光闌的邊框上刻有表示開啟口徑的尺度，可以根據刻度來進行配合。顯微鏡用畢后的處理1、上升鏡筒，取下載玻片。

2、用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。

切忌用手或其他紙擦拭鏡頭，以免使鏡頭沾上污漬或產生劃痕，影響觀察。

3、用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。

4、將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉成“八”字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。罩上防塵套。五、收放顯微鏡的操作規(guī)程1、自顯微鏡柜子或木盒內取出時，要用右手握緊執(zhí)手，把顯微鏡輕輕拿出。由于鏡體較重，必須用左手托住鏡座，才能做較遠距離的搬動。2、將顯微鏡置于實驗臺上時，應放在身體的左前方，離桌子邊緣約30毫米處。右側可放記錄本或繪圖紙等。1．右手握住鏡臂，左手托住鏡座。

2．把顯微鏡放在實驗臺距邊緣3～5cm左右處，略偏左。安裝好目鏡和物鏡。取鏡和安放顯微鏡的操作規(guī)程3、使用顯微鏡前，首先要調節(jié)好光源。在實驗室中可利用燈光或自然光，但不能用直射的陽光，以免損傷眼睛。為了迅速而正確地對光，應先用10×物鏡，把光圈放到最大位置。在用眼睛觀察目鏡中視野的同時，轉動反光鏡，使視野的光線最明亮、最均勻。如果靠近光源，可用平面的反光鏡；如果光源距離較遠，可用凹面的反光鏡。有的顯微鏡如不具有聚光器，則應用凹面的反光鏡。對光1、轉動轉換器，使低倍物鏡對準通光孔（物鏡前端與載物臺要保持2cm距離)。2、把一個較大的光圈對準通光孔。一只眼注視目鏡內，另一只眼睜開。轉動反光鏡，使光線通過通光孔反射到鏡筒內。通過目鏡可以看到白亮的圓形視野。對光顯微鏡的操作規(guī)程4、把制片放在顯微鏡的鏡臺上，要觀察的部位應準確地移到物鏡的下面，然后用壓片夾壓緊。5、觀察時要睜開雙眼，調節(jié)兩目鏡距離至合適；（單目）用左眼觀察顯微鏡目鏡視野中的象。2、放置玻片標本將制好的玻片，從壓片夾后部的縫隙處插入，然后雙手向前平推，使標本正對通光孔中心。觀察前的準備放置標本

把所要觀察的玻片標本放在載物臺上，用壓片夾壓住，標本要正對通光孔的中心。顯微鏡的操作規(guī)程6、進行觀察時，應先用10×物鏡。為了避免物鏡壓壞制片（在使用高倍物鏡時最易發(fā)生），必須用下面方法聚焦：即一方面從側面注視物鏡與制片間的距離；一方面轉動粗聚焦器，使鏡筒逐漸下降，直到接近蓋玻片為止。然后觀察目鏡視野，慢慢轉動粗聚焦器使鏡筒逐漸上升，直到看清制片中的影象為止。觀察調焦

一只眼向目鏡內看，同時逆時針方向轉動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩上升直到看清物像為止。再略微轉動細準焦螺旋，使看到的物像更加清晰。

下降鏡筒

轉動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標本為止（此時眼睛一定要看著物鏡）。觀察和繪圖顯微鏡的操作規(guī)程7、觀察制片時，首先在低倍物鏡下了解制片上的概況，如果所要觀察部分位于視野的一側，則要移動制片，將要觀察的部位移到中央。移動制片時應注意顯微鏡中所形成的象是倒象，因此要改變圖象在視野中的位置時，需向相反的方向移動制片。顯微鏡的操作規(guī)程8、細聚焦器是顯微鏡上最易損壞的部件之一，要盡量保護。一般用低倍物鏡觀察時，用粗聚焦器就可以調好焦距，不用或盡量少用細聚焦器。使用高倍物鏡如需要用細聚焦器聚焦時，其旋鈕轉動量最好不要大于半圈。顯微鏡的操作規(guī)程9、需詳細觀察制片中某一部分細微結構時，可先在低倍物鏡下找到最合適的地方，并移至視野中央，然后轉動鏡頭轉換器用高倍物鏡（40×）觀察。當換到高倍物鏡后，應該看到制片中的影象。如果影象不清楚時，順時針或逆時針方向轉動細聚焦器，直到影象清晰為止。如果轉換高倍物鏡后看不到影象，可能所觀察的對象沒有在視野中央的位置，需要轉換到低倍物鏡，重新調正制片位置。顯微鏡的操作規(guī)程10、當影象看到以后，還要用光圈調節(jié)光束的粗細。這一點很重要，如果光束過于粗大，光線過強，將使一些較為透明的結構不易看清；如果光束過細，光量不足，將使影象灰暗不清。因此必須調節(jié)光圈，達到最好的觀察效果。在調節(jié)光圈時，不要觸動反光鏡，以免改變光線的折射方向。使用顯微鏡時必須遵守的規(guī)則1、任何旋鈕轉動有困難時，絕不能用力過大，而應查明原因，排除障礙。如果自己不能解決時，要向專業(yè)維修人員說明，幫助解決。2、保持顯微鏡的清潔，盡量避免灰塵落到鏡頭上，否則容易磨損鏡頭。必須盡量避免試劑或溶液沾污或滴到顯微鏡上，這些都能損壞顯微鏡。特別是高倍物鏡很容易被染料或試劑沾污，如被沾污時，應立即用擦鏡紙擦拭干凈。顯微鏡用過后，應用清潔棉布輕輕擦拭（不包括物鏡和目鏡鏡頭）。使用顯微鏡時必須遵守的規(guī)則3、要保護物鏡、目鏡和聚光器中的透鏡。光學玻璃比一般玻璃的硬度小，易于損傷。擦拭光學透鏡時，只能用專用的擦鏡紙，不能用棉花，棉布或其它物品擦拭。擦時要先將擦鏡紙折疊為幾折（不少于四折），從一個方向輕輕擦拭鏡頭，每擦一次，擦鏡紙就要折疊一次。然后繞著物鏡或目鏡的軸旋轉地輕輕擦拭。如不按上述方式擦拭，落在鏡頭上的灰塵很易損傷透鏡，出現(xiàn)一條條的劃痕。使用顯微鏡時必須遵守的規(guī)則4、每次實驗結束時，應將物鏡轉成八字形垂于鏡筒下，以免物鏡鏡頭下落與聚光器相碰撞。也可用清潔的白紗布，墊在鏡臺與物鏡之間。5、將鏡身下降到最低位置，調節(jié)好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。

1、必須遵守實驗操作規(guī)程，否則影響實驗效果或會損壞儀器。例如，光線若對不好，物像就看不清，準焦螺旋如不按規(guī)定操作，就容易砸碎裝片或切片，甚至損壞物鏡。

2、必須保護好鏡頭。不能用手撫摸透鏡，以防止汗?jié)n沾污，更不能讓透鏡與硬物接觸，以防止損壞透鏡，擦拭鏡頭一定要用專用的擦鏡紙。3、載物臺要保持清潔干燥，不要讓裝片或切片上的水流到載物臺上。

注意事項

4、不要任意轉動鏡頭轉換器和準焦螺旋。轉動準焦螺旋時不要用力過猛，以防止機件損傷、脫落