微生物學顯微鏡油鏡的使用和細菌形態(tài)的觀察第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日一、實驗目的了解并掌握油鏡的原理和使用方法；掌握細菌革蘭氏染色的原理和方法，學會在油鏡下觀察細胞和識別細菌的形態(tài)特征。第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日二、實驗材料

1、菌種：大腸桿菌、葡萄球菌

2、儀器：顯微鏡

3、染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、Lugol碘液、95％乙醇、復紅染色液

4、材料：載玻片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日三、顯微鏡及油鏡使用原理（一）普通光學顯微鏡構(gòu)造（p.23-27）1.光學部分:接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,造成物象。2.機械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日圖1-1-2光學顯微鏡的成像原理倒立的虛像第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.

顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為：D=0.61λ/n·Sinα/2式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:

物鏡和被檢標本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日（二）油鏡使用的原理

油鏡，即油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。根據(jù)公式D=0.61λ/n·Sinα/2

，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.油鏡使用結(jié)束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第三遍再用干凈的擦鏡紙擦去多余的二甲苯。6.顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。（三）顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日三.顯微鏡油鏡觀察操作方法在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域滴加香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接。然后用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，在目鏡下找到最合適的觀察點。

第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日一、實驗目的進一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步認識細菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)特征四、細菌形態(tài)的觀察第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日二、觀察內(nèi)容基本形態(tài)：桿菌，球菌（注意大小、染色性、排列）特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛，芽胞，莢膜（先找到菌體，再仔細觀察特殊結(jié)構(gòu)）以畫圖的方式完成該實驗的報告第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日圖下標示：1、菌種：桿菌（大腸桿菌，G-）2、放大倍數(shù)3、觀察方法畫圖注意事項：1、以圓圈表示視野

2、注意菌體大小比例合適

3、標出菌體顏色，顯示典型排列方式

4、特殊結(jié)構(gòu)標出菌體和特殊結(jié)構(gòu)所在位置第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日五、革蘭氏染色（一）、實驗目的學習微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日（二）、革蘭氏染色的工作原理革蘭氏染色法是細菌學中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應。第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間細胞壁的結(jié)構(gòu)差異來達到染色的目的的。先用結(jié)晶紫初染，所有的細菌都被染成初染料的藍紫色；然后用碘媒染，它與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘復合物，從而增強了染料與細菌的結(jié)合力。然后再用乙醇脫色處理第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日經(jīng)典法，四步法（p.30-32）第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日由于革蘭氏陽性菌細胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、壁厚、類脂質(zhì)含量低，脫色時網(wǎng)孔收縮，結(jié)晶紫—碘不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，復染時仍保持藍紫色。而革蘭氏陰性菌由于細胞壁的肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時類脂被乙醇溶解，細胞壁透性增大，結(jié)晶紫—碘復合物被洗脫，復染時細胞被染上復染劑的顏色（紅色）。第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日（三）、實驗操作p.31，采用三區(qū)涂片法步驟：1、在玻片的左右端各加1滴水，用無菌接種環(huán)挑少量金黃色葡萄球菌與左邊水滴充分混合成僅有金黃色葡萄球菌的區(qū)域，并將少量菌液延伸至玻片的中央。2、用無菌的接種環(huán)挑少量大腸桿菌與右邊水滴充分混合成僅有大腸桿菌的區(qū)域，并將少量大腸桿菌菌液延伸至玻片中央，與金黃色葡萄球菌混合成含有兩種細菌的混合區(qū)。第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日（四）、革蘭氏染色的操作方法無菌操作涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢第二十頁，共二十六頁，2022年，8月28日大腸桿菌葡萄球菌第二十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日（1）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小環(huán)培養(yǎng)24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體于生理鹽水中涂片，（分別于斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開，使其分布均勻。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚第二十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日載玻片水滴菌體涂片第二十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日（2）干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。（3）涂面朝上，在火焰上方過幾次以熱固定菌體。固定時通過火焰1—2次即可。染色前必須固定細菌，其目的是：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上。二是增加其對染料的親和力。常用加熱固定法。固定時盡量維持細胞原有的形態(tài)。注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細胞形態(tài)。（4）初染：滴數(shù)滴結(jié)晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌膜為宜）初染1--2分鐘min，水洗。（5）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。第二十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日（6）脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20—30s，立即用水沖凈酒精。

注意：革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應甩去細胞上的殘水，以免染色液被稀釋。第二十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日（7）復染：用番紅液染1—2min,水洗。