生理鹽水壓力對兩個水稻品種種子的發(fā)芽，抗氧化反應以及脯氨酸含量的影響l=J

應以及脯氨酸含量的影響l=J

I三m我們調(diào)查了兩個水稻品種，一個是耐鹽的”東進”，一個是鹽敏感“KM”。在萌發(fā)和幼苗階段我們進行了鹽漬水培研究。在氯化鈉抑制萌發(fā)方面“KM”比“東進”更為嚴重。如果增加鹽濃度會在更大程度上阻止水稻的生長。此外，“KM”的葉子顯示出，KM的脂質(zhì)過氧化作用和鈉離子的積累在相同的鹽壓力下比東進多。而東進的本構(gòu)的活動和鹽誘導超氧化物歧化酶（SOD,EC1.15.1.1）以及抗壞血酸鹽過氧化物酶高于“KM”，而東進只有過氧化氫酶活動強度略高。葉片的脯氨酸含量和氯化鈉濃度之間的正相關(guān)關(guān)系在“KM”表現(xiàn)更為明顯。然而,東進的種子發(fā)芽力在高氯化鈉時較高，并且能積累更多的脯氨酸。這些結(jié)果表明，耐鹽的東進幼苗可以歸因于葉子中接累了較少的氯化鈉。這大概是由于減少了芽根對于鹽離子的吸收以及離子的運輸率。最后,我們認為東進之所以有較高的發(fā)芽率是因為其種子脯氨酸含量較高。氯化鈉是鹽水環(huán)境中最重要的組成部分。在氯化鈉壓力下，植物生長緩慢，原因是氯化鈉通過影響植物代謝的幾個重要的方面，從而使其生長緩慢。比如植物的蒸騰作用，植物對光照吸收，植物的呼吸作用和二氧化碳的同化作用，細胞的生長和分裂，以及植物激素的平衡，氮含量，代謝酶的活性水平，水的供應，離子的攝取，和滲透壓的調(diào)節(jié)等等。鹽的濃度的大小也能在種子發(fā)芽期間引起眾多破壞，比如種子和繁殖體的損壞。這些不同的環(huán)境壓力下造成的消極影響，我們假定有一部分是由于生成的活性氧（AOS）抑制即抵御他們造成的。其中AOS包括超氧陰離子（02），羥基自由基（9OH），過氧化氫（H2O2），和單線態(tài)氧（102）。在增加AOS的過程中，植物體本身也有正常的有氧代謝，似乎這個過程的發(fā)生是針對所有非生物脅迫，例如寒冷，重金屬離子，干旱，和鹽脅迫等。AOS在未淬火或未滅活的情況下可能導致細胞的膜脂質(zhì)，大分子的蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸會降解成小分子。植物具有一連串的抗氧化機制，因此能夠進行自我解毒以及消除這些AOS。該防御系統(tǒng)機制包括親水的抗氧化劑（如抗壞血酸，谷胱甘肽），和疏水的抗氧化劑（如O生育酚，類胡蘿卜素）以及酶如超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1），抗壞血酸過氧化物酶（AP，EC1.11.1.11），過氧化氫酶（CAT，EC1.11.1.6）和谷胱甘肽還原酶（EC1.6.4.2）。環(huán)境壓力所造成的阻力通常與有效的抗氧化系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)。這些滲透保護劑能夠提高細胞質(zhì)滲透壓，在鹽濃度或是溫度不適宜時候，能在穩(wěn)定細胞膜中的蛋白質(zhì)中發(fā)揮重要角色，這種滲透保護劑有三個類型：（1）甜菜堿和相關(guān)化合物，（2）多醇和糖，（3）氨基酸如脯氨酸。存在一種比較普遍的現(xiàn)象，脯氨酸的積累會使植物暴露于鹽或水分壓力下，這種現(xiàn)象已經(jīng)在很多植物品種身上體現(xiàn)出來了。這些植物自身都能夠適應滲透脅迫。然而，目前，機械的傳授耐鹽脅迫是有爭議的，一些研究人員推測它是應力損傷的癥狀，而不是一個指示器的脅迫耐受性。因此，必須更精確地研究在鹽脅迫下脯氨酸積累的作用應力。賴斯是一個適度耐鹽的作物，這種作物表現(xiàn)出一系列鹽度敏感性。目前的研究旨在確定，除了他們的生長，兩個水稻品種在萌芽率，膜的過氧化反應，抗氧化劑酶活性，脯氨酸積累量，之間存在的差異。材料和方法植物材料和鹽脅迫處理“東進'和'KM'水稻種子分別用0.05%咪鮮胺消毒并且用乳油浸泡24小時，然后用蒸餾水徹底漂洗干凈從而能夠清除殘留的消毒劑。通過對NaCl脅迫抑制萌發(fā)的評估，然后兩種水稻品種分別隨機選取100粒種子，每100粒種子都分別涂上Whatman2溶劑，并保存在9厘米直徑的培養(yǎng)皿中。，并在之后加入5毫升蒸餾水和不同濃度的氯化鈉溶液。讓該種子在30攝氏度的黑條件下發(fā)芽六天后，并分別在2,3和5天后，將5ml蒸餾水或一個NaCl溶液（45,90，180或270mM）中加入到培養(yǎng)皿中。發(fā)芽的種子的數(shù)目每六天記一次數(shù)。為了鑒定NaCl脅迫是如何抑制幼苗生長，把種子放置在被蒸餾水浸濕的塑料容器中的金屬網(wǎng)上萌發(fā)。然后他們被水培在一個受控的生長室（16小時光照，晝夜最高和最低溫差在22和30攝氏度之間，70%RH），其中包含0.88mM硫酸鉀，1mM的Ca（NO3）2，1mM的（NH4）2SO4，1mM干燥MgSO4，0.25mMKHPO4，0.1mM氯化鉀，40uM的FeEDTA，10uMH3BO4，1uM硫酸錳，1uM硫酸鋅，0.1uM硫酸銅和0.01uM（NH4）6MoO24。用1NHCL將該溶液ph調(diào)節(jié)至5.8，并每兩天進行交換一次。為了分析脂質(zhì)過氧化作用機制，以及抗氧化酶活性和脯氨酸的積累，要進行葉子樣品的收集，稱重，并儲存在零下70攝氏度環(huán)境中。所有實驗均獨立地至少重復三次。生長測量生長速率測定時，隨機選擇鹽水處理過的水稻種子比較合適。鈉離子測定水稻葉子樣品在90攝氏度條件下烘干48小時，然后研磨成粉末并裝在玻璃試管中。加入相關(guān)溶劑，在1NHCl晃動24小時，并用濾紙過濾提取鈉離子。鈉離子的濃度能夠通過電感耦合等離子體光譜發(fā)測定。脂質(zhì)過氧化作用脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物是丙二醛（MDA）。將0.5克被研磨成粉末狀的葉片用液氮混合5ml冷乙醇萃取。取粗提取物制劑12克并離心20分鐘。得到三氯乙酸，硫代巴比妥酸，丁基羥基甲苯的混合物，將上清液試樣等分并加熱，然后快速將所述混合物在冰浴中停止反應。將冷卻的混合物離心，提取的上清液，測定上清液中的分子直徑在400，500，和600納米范圍內(nèi)。硫代巴比土酸反應物質(zhì)被測定是MDA，其降解產(chǎn)物是脂質(zhì)?？寡趸阜治鰧?.5克冷凍的樣品研磨成細粉末，并用液氮混合50mM磷酸鉀緩沖液（pH7.0），乙二胺四酸，0.2mM的抗壞血酸和10%不溶性聚乙烯毗咯烷酮進行萃取。取提取物12克并離心20分鐘，并在4攝氏度環(huán)境下測定上清液中酶的活動。所有的活動的測定必須在25攝氏度環(huán)境下，使用上清液是上述的等分試樣。

超氧活動氧化物歧化酶（SOD,EC1.15.1.1）的測定通過麥科德的描述方法測定，混合物由50mM磷酸鉀緩沖液（pH7.8），0.1毫黃嘌吟單鈉鹽，10毫細胞色素C，黃嘌吟氧化酶組成，將此混合物試樣等分?？箟难徇^氧化物酶活性是通過監(jiān)測和測量抗壞血酸在290納米下的氧化速率。該反應混合物由50mM鉀磷酸鹽緩沖液（pH7.0），0.1mM的H2O2,0.5毫抗壞血酸鹽，及粗酶的等分試樣組成。對過氧化氫酶的活性測定，是根據(jù)布盧姆和麥克盧爾的方法，他們的方法通過監(jiān)測在240nm處的吸光度的降以及H202的氧化程度。反應混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液（pH7.8），5mM的H2O2。脯氨酸含量脯氨酸含量的測定是根據(jù)Bates等人確定的的方法。第一，1,東進'和'制100粒種子中的每個種子是在EFT環(huán)境下無涂層干燥4周，這個過程在環(huán)境溫度下進行。其次，以評估葉子中脯氨酸的含量，0.5g的冷凍組織研磨液與液體氮在10ml的3%的磺基的酸的環(huán)境下進行充分混合。并且取十二克種子和葉的勻漿在4攝氏度條件下離心20分鐘。之后在上清液中加入乙酸和茚三酮，然后煮沸1小時，以此確定脯氨酸的水平。結(jié)論氯化鈉抑制發(fā)芽在不接觸氯化鈉脅迫的環(huán)境下，’東進'水稻種子比'Kurnnam'水稻種子發(fā)芽快（如圖1所示），但隨著鹽度的上升，發(fā)芽率都在下降?！癒M'比'東進的抑制效果更加明顯’。例如，在氯化鈉脅迫六天后，東進萌芽率仍大于83%。氯化鈉抑制增長2Dr459a榮36DA況三：1n圖LI°w.EMaJc2Dr459a榮36DA況三：1n圖LI°w.EMaJc20016012080還代。圖2:.鹽度由于鹽的濃20016012080還代。圖2:.鹽度由于鹽的濃發(fā)現(xiàn)三東進”生脂質(zhì)過氧化作，相互對.度增加，兩種水稻的鮮重都下降長較少，相比KM抑制作用用 M三，相互對.在葉子被氯化鈉處理的六天后（圖3），把MDA在葉子被氯化鈉處理的六天后（圖3），把MDA含量作為脂質(zhì)過氧化作用的指標。在45mM氯化鈉溶液中，這兩個水稻品種的MDA含量均小幅升高但都有所回落，在90mM的NaCl溶液中。與對照植株相比“東進”的脂質(zhì)過氧化作用?同比增長156鈉離子濃度 °%，KM同比增長240%。3DaysafterNaCItreatment%，KM同比增長240%。3圖3O隨著時間的推移，在氯化鈉脅迫下，鈉離子的積累東進相比KM更高（圖4）。

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鄒3D10±葉.“東進?.和?妙”水稻幼苗的影響。3—'Dangjin'■'Donghn1—二一'Kumnam'■—'Kurrinam'—?*'―'Kumnan'i1n圖4:鹽分中的鈉離0:0抗氧化酶活性Daysaftertreatment“KM”在SOD本構(gòu)的構(gòu)活性上相比東進更高（圖5A）。當兩品種分別在45和90mM的NaCl溶液中處理后，東進的超氧化物歧化酶活動增加了17%以上，但“KM”幾乎沒有變化。然而，在90mM的氯化鈉溶液中，KM比東進活性高20%。同樣，KM本構(gòu)中AP的活性是在無氯化鈉壓力時更高（圖5B）。分別用45mM氯化鈉處理，“東進”和“KM”的AP活性均提高到14%和10%。雖然兩個品種的CAT的組成活性幾乎相同（圖5C），但當在45和90mM的NaC環(huán)境下生長，其含量提高13%和15%。Msoa--￥一5苔rr85胃“KM0XumnjinMsoa--￥一5苔rr85胃“KM0Xumnjin(B)表1.CultivarsIV(j|inc

(gmol§seed)1.6?±O.O5Kumnarn0,63i0.05表1.CultivarsIV(j|inc

(gmol§seed)1.6?±O.O5Kumnarn0,63i0.05r*圖6鹽度在水稻葉片中有脯氨酸積累的環(huán)境下對東進和KM水稻幼苗的積累。脯氨酸積累對于東進水稻品種的種子，脯氨酸含量比KM脯氨酸含量的計算值高了257%（表1）在葉組織中脯氨酸的積累，東晉比'KM'略高，并在氯化鈉壓力下分別分別大大增加了，雖然有顯著不同的圖案（圖6所示）。討論穆罕默德和森1990年提出，發(fā)芽抑制是由鹽水的滲透脅迫或是有特定毒性的離子造成的。這種反應是種子能夠從鹽溶液中逆轉(zhuǎn)水分到蒸餾水。在這項研究中，在鹽度治療期，“東進”比“KM”萌發(fā)要好（如圖1所示），這表明前者能夠更加忍耐氯化鈉的誘導壓力。通常假定，植物對鹽度的抵抗力在于它能夠限制或阻止鈉離子從根進入到枝葉的能力。通常情況下，較高的鈉含量破壞了營養(yǎng)平衡和滲透調(diào)節(jié)，從而使離子具有了特定的毒性（阿蘭，1999年）。在這項研究中，在高濃度的氯化鈉溶液中，對鹽敏感的KM'（如圖2所示）葉片上的鈉離子的積累相比耐鹽性的”東進”而言更加明顯。（如圖4所示）。這些結(jié)果與其他的研究結(jié)果一直，表明鈉離子濃度和耐鹽性之間成反比關(guān)系。用NaCl治療也增大脂質(zhì)過氧化作用或誘導植物組織的氧化應激（埃爾南德斯等人，1994;Olmes等人，1994;格賽特等人，1996年）。在這里，我們監(jiān)測了過氧化程度通過測量丙二醛對植物的傷害和當在多不飽和的脂肪酸溶液中產(chǎn)生的膜進行過氧化反應。雖然，在無鹽處理情況下，東進和kumnan有著同樣水平的丙二醛含量。但是在氯化鈉壓力下，東進的丙二醛含量會增加（如圖3所示）。和東進不同的是，當KM暴露在90mM的氯化鈉溶液中，丙二醛含量會明顯增加，也許是因為通過抗氧化酶減少了活動。博爾曾經(jīng)在2003年表明，相比對鹽并不敏感的甜菜屬，野生耐鹽甜菜展現(xiàn)了一個更好的保護機制，它是通過維持較高的本構(gòu)和損害，以及鹽引起的抗氧化酶的活動，如SOD，AP和CAT等。此外，Scandalios在1993年曾報道，SOD和CAT是防止細胞傷害的最有效的抗氧化劑。我們的研究結(jié)果表明，東進和KM'相比，SOD和AP的活性均較低（圖5由A和B可知），雖然二者均有比例的增加氯化鈉的濃度。不過，CAT本構(gòu)活性兩個品種基本類似（由圖5c可知）并且經(jīng)過短暫鹽處理后，僅增加東進品種的CAT本構(gòu)活性增加。因此，基于我們自己的活動進行分析，我們認為，這些抗氧化酶（例如超氧化物歧化酶，AP和CAT）在我們的兩個水稻品種對降低鹽脅迫的影響不大。為了應對干旱和鹽堿脅迫，許多植物物種積累了高水平的脯氨酸，這被認為是一種壓力調(diào)適功能。然而，由于缺乏相關(guān)的一定水平的脯氨酸和耐鹽性，也導致了一些植物品種出現(xiàn)結(jié)論中所提及到的“這種積累僅僅是損傷的癥狀，并且不提高耐受性”。這更明顯的增加了游離脯氨酸含量鹽敏感性比抗鹽水稻品種。在這里，我們證明了在這兩個品種中脯氨酸的積累都緊密的和氯化鈉濃度有關(guān)。（如圖6所示）這個實驗表明，不耐鹽植物氯化鈉壓力下對脯氨酸的積累，不是保護植物自身的一個指標價值，而僅僅是一個后果或癥狀的應力。與此相反，種子在組成型脯氨酸的含量上，’東進’比'KM“高，前者還具有較高鹽度脅迫下的發(fā)芽率（如圖1所示）。1994年也有報道說，NaCl的壓力會導致脯氨酸在發(fā)芽種子中積累。