內(nèi)容(contents)原理分子熒光與磷光產(chǎn)生過程激發(fā)光譜與熒光光譜熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系影響熒光強(qiáng)度的因素儀器應(yīng)用第1頁/共52頁第一頁，共53頁。發(fā)光現(xiàn)象起因是吸收了外在提供的能量引起的外在的能量熱電光化學(xué)能第2頁/共52頁第二頁，共53頁。熒光入射光熒光1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍為長(zhǎng)些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長(zhǎng)的光。他還由發(fā)熒光的礦物“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語.

第3頁/共52頁第三頁，共53頁。螢石純凈的螢石為無色，但因含有較多Y、Ce等元素，造成螢石結(jié)構(gòu)空位，產(chǎn)生色心而致色，常見的顏色有淺綠色至深綠色，藍(lán)、綠藍(lán)、黃、酒黃、紫、紫羅蘭色、灰、褐、玫瑰紅、深紅等。第4頁/共52頁第四頁，共53頁。

2001年美國(guó)遭受911襲擊時(shí)，美國(guó)世貿(mào)大廈內(nèi)一共有2萬5千多人，人們驚訝地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)世界都為之驚嘆的紀(jì)錄：兩座大樓里，1萬8千多人在上百層的大樓完全斷電的情況下，在一個(gè)半小時(shí)之內(nèi)成功逃生。第5頁/共52頁第五頁，共53頁。綠色熒光蛋白GFP綠色熒光蛋白第6頁/共52頁第六頁，共53頁。GFP第7頁/共52頁第七頁，共53頁。原理GenerationofMolecularFluorescenceandPhosphorescence第8頁/共52頁第八頁，共53頁。熒光和磷光的產(chǎn)生過程分子能級(jí)和躍遷電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)基態(tài)（S0）→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)）：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第9頁/共52頁第九頁，共53頁。熒光和磷光的產(chǎn)生過程電子激發(fā)態(tài)的多重度單重態(tài)S三重態(tài)T大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率??；

第10頁/共52頁第十頁，共53頁。激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；第11頁/共52頁第十一頁，共53頁。能級(jí)圖S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫第12頁/共52頁第十二頁，共53頁。非輻射能量傳遞過程振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。

通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。

改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。第13頁/共52頁第十三頁，共53頁。輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為‘2的熒光；10-7～10-9

s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；‘2>2>1；

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1→S0躍遷）；

電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。第14頁/共52頁第十四頁，共53頁。激發(fā)光譜熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線（圖中曲線I）激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；第15頁/共52頁第十五頁，共53頁。熒光（磷光）光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。第16頁/共52頁第十六頁，共53頁。光譜例子第17頁/共52頁第十七頁，共53頁。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜關(guān)系

Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如‘2)。鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。第18頁/共52頁第十八頁，共53頁。鏡像規(guī)則

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

第19頁/共52頁第十九頁，共53頁。鏡像規(guī)則200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜第20頁/共52頁第二十頁，共53頁。分子產(chǎn)生熒光的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件具有合適的結(jié)構(gòu)（強(qiáng)的紫外可見吸收）具有一定的熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率（）熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射第21頁/共52頁第二十一頁，共53頁。化合物的結(jié)構(gòu)和熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。第22頁/共52頁第二十二頁，共53頁。熒光和取代基第23頁/共52頁第二十三頁，共53頁。長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)共軛系統(tǒng)↑→f↑→ex、em↑第24頁/共52頁第二十四頁，共53頁。取代基供電子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN

→f

↑，F(xiàn)↑吸電子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、

-C=O、-NO、-SH、-X

→f

↓，F(xiàn)↓，甚至熒光熄滅-R、-SO3H、-NH3+→對(duì)f

無影響

第25頁/共52頁第二十五頁，共53頁。影響熒光的外部效應(yīng)1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；極性↑→f↑→F↑→↑粘度↓→分子間碰撞幾率↑→F↓含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓形成氫鍵→S1*(V=0)分子↓→F↓第26頁/共52頁第二十六頁，共53頁。影響熒光的外部效應(yīng)2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；

pH<2pH7~12pH>13蘭色熒光第27頁/共52頁第二十七頁，共53頁。影響熒光的外部效應(yīng)4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；第28頁/共52頁第二十八頁，共53頁。影響熒光的外部效應(yīng)5.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅:熒光物質(zhì)濃度超過1g/L時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。(濃度限量1g~1mg/ml)熒光熄滅劑(quenchingmedium)：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。第29頁/共52頁第二十九頁，共53頁。儀器Instruments第30頁/共52頁第三十頁，共53頁。儀器結(jié)構(gòu)流程測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。第31頁/共52頁第三十一頁，共53頁。光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源第32頁/共52頁第三十二頁，共53頁。同步掃描技術(shù)根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種；

同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。

合適的可減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。第33頁/共52頁第三十三頁，共53頁?？色@得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖第34頁/共52頁第三十四頁，共53頁。熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別

紫外-可見分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)光路光源儀器校正吸收池入射光與吸收光同方向入射光與熒光垂直方向兩種光源(紫外+可見)一種光源(紫外)空白溶液(F=0)熒光對(duì)照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外無吸收兩面透光低熒光材料四面透光第35頁/共52頁第三十五頁，共53頁。熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？檢測(cè)下限：0.1～0.1g/cm-3

相對(duì)靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。第36頁/共52頁第三十六頁，共53頁。定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc第37頁/共52頁第三十七頁，共53頁。定量依據(jù)與方法（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；第38頁/共52頁第三十八頁，共53頁。多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測(cè)定可分別在各自的熒波長(zhǎng)處測(cè)定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定第39頁/共52頁第三十九頁，共53頁。多組分混合物的熒光分析激發(fā)光譜和發(fā)射光譜都互相干擾利用熒光強(qiáng)度的加和性（If=If1+If2+If3+…），在適宜的熒光波長(zhǎng)處測(cè)定，用聯(lián)立方程來求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nmem=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度,或410nm下激發(fā)在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度,第40頁/共52頁第四十頁，共53頁。41在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度If=Kc——K:純物質(zhì)在選定波長(zhǎng)下測(cè)If,求K或410nm激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度If435/385=26339104cT+210104cPIf480/385=9685104cT+1022104cPIf480/410=2816104cT+1709104cPIf435/410=6419104cT+252104cP硫胺熒濃度吡啶硫胺熒濃度第41頁/共52頁第四十一頁，共53頁。熒光分析法的應(yīng)用(1)無機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見表第42頁/共52頁第四十二頁，共53頁。第43頁/共52頁第四十三頁，共53頁。第44頁/共52頁第四十四頁，共53頁。有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析。芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法。為提高測(cè)定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)定。第45頁/共52頁第四十五頁，共53頁。維生素B2——又稱核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。在低濃度情況下，I=Kc，I與c呈線性關(guān)系。在ex光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=525nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定。缺VB2會(huì)得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎第46頁/共52頁第四十六頁，共53頁。3，4–苯并芘的測(cè)定3，4–苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車尾氣也是主要來