一、細胞融合的目的和意義

細胞融合能實現遠緣雜交。其意義在于打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方法無法獲得的新型雜種植物，廣泛組合各種基因型，擴大了遺傳物質的重組范圍。第1頁/共54頁第一頁，共55頁。二、細胞融合（cellfusion)概念在外力（誘導劑或促融合劑）作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現象。

通過細胞培養(yǎng)技術，這個細胞有可能發(fā)育成完整的生物個體，這個雜種后代有可能兼有兩個上代的一些優(yōu)良性狀。第2頁/共54頁第二頁，共55頁。細胞在融合過程中發(fā)生的主要變化：

呈致密狀態(tài)的體細胞在促融合劑的作用下，細胞膜的性質發(fā)生變化。首先出現細胞凝集現象；然后部分凝集細胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而融合形成多核細胞；在培養(yǎng)過程中多核細胞又進行核的融合而成為單核的雜種細胞，而那些不能形成單核的融合細胞在培養(yǎng)過程中逐漸死亡。第3頁/共54頁第三頁，共55頁。三、細胞融合技術原理和方法

由于體外培養(yǎng)的細胞很少會發(fā)生自發(fā)融合（融合頻率大約在10-4~10-6之間），因此要采用生物、化學或物理的方法人為地促使細胞融合。

第4頁/共54頁第四頁，共55頁。促細胞融合的方法有：

（一）病毒促進細胞融合

其中仙臺病毒（HVJ）是最早用于動物細胞融合的融合劑。

（二）化學融合劑促進細胞融合

主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇（PEG）、二甲亞砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質、Ca2+配合物等。

（三）電處理融合法第5頁/共54頁第五頁，共55頁。聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)融合

在眾多的化學試劑中，PEG應用最為廣泛，因PEG液比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便、而且促進細胞融合的能力更強。PEG是一種多聚化合物。第6頁/共54頁第六頁，共55頁。PEG誘導原生質體融合的機理：

帶有大量負電荷的PEG與水之間的氫鍵結合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質體凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生質體發(fā)生皺縮并大大扭曲變形，鄰近原生質體之間緊密接觸。第7頁/共54頁第七頁，共55頁。

在原生質體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內蛋白質顆粒易位并凝聚。接著可能是相鄰的剝去蛋白質的細胞膜間的類脂質與類脂質反應。繼之，類脂質分子的擾動和重排導致接觸的細胞膜局部發(fā)生融合，形成很小的細胞質橋，之后它逐漸擴大，兩個原生質體最終融合。

第8頁/共54頁第八頁，共55頁。

使用化學促融劑時，Ca2+是必需的。關于Ca2+的作用機理，有的認為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成為細胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為Ca2+結合到帶負電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。第9頁/共54頁第九頁，共55頁。電融合（electrofusiontechnique)法：

電處理融合法是20世紀80年代發(fā)展起來的細胞融合技術，使融合率大為提高。第10頁/共54頁第十頁，共55頁。Electroporator2510fromBrinkmannModelECM830fromBTX第11頁/共54頁第十一頁，共55頁。電融合過程的分子機制：

是以電降解及雙向電泳的聯合作用為基礎。通過電泳，兩細胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質分子分離，產生了無蛋白的類脂區(qū)。第12頁/共54頁第十二頁，共55頁。

電脈沖作用時引起膜結構局部擾亂，出現小孔洞。而相對的脂雙層間分子在范德華力作用下，形成脂分子橋。由于連接處的細胞膜表面曲率大，處于高張力狀態(tài)，在熱力學上是不穩(wěn)定的，所以最終導致兩細胞逐漸融合成一個圓形的大球狀細胞。第13頁/共54頁第十三頁，共55頁。AAlignment:Cellsarebroughtintoclosecontactbymeansofdielectrophoresis.BFusionpulse:Asquarewavepulseofamere15microsecondsisappliedinordertopermeatethemembrane.Themembranesthenfuse.CHeterokaryonphase:Thecellmembranesarefusedcompletelyandthecytoplasmhasmixedtogether.Onlythenucleiremainseparate.DEntirefusionproduct:Thenucleiarenowfusedaswell.Asarule,thenumberofchromosomesisreduced.第14頁/共54頁第十四頁，共55頁。Fusionphasesofoatprotoplasts(Avenasativa)第15頁/共54頁第十五頁，共55頁。

實際操作：

先把待融合的細胞或原生質體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場中，在非均勻交流電場中形成項鏈狀排列；

完整煙草原生質體（40×）

原生質體成串（40×）第16頁/共54頁第十六頁，共55頁。

再用1~5V/cm直流電脈沖/微秒沖擊細胞或原生質體的粘接點，細胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細胞質得以交換；最后導致新的球狀細胞的形成。第17頁/共54頁第十七頁，共55頁。電融合法優(yōu)點（與PEG法比較）：

1、融合率高；

2、重復性強；

3、誘導僅發(fā)生在質膜接觸部位，對細胞或原生質體傷害小；

4、融合是在同步狀態(tài)下進行，活細胞數目多；

5、裝置精巧，方法簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；

6、免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控制性強。Electrofusion第18頁/共54頁第十八頁，共55頁。四、實驗材料、試劑和儀器

1.材料

無菌煙草葉片、洋蔥根尖第19頁/共54頁第十九頁，共55頁。2.試劑

1）酶混合液

配制分兩部進行：

（1）將CaCl2.2H2O7mmol/L

NaH2PO4.2H2O0.7mmol/L

MES3mmol/L

甘露醇0.5mmol/L

用重蒸餾水溶解，調pH5.6，定容為酶儲備液，滅菌備用。第20頁/共54頁第二十頁，共55頁。（2）使用時再加入：

纖維素酶R-100.8%

果膠酶R-101%

因酶制劑經過高壓滅菌處理后會失活，故先將酶儲液滅菌，待用時再將酶制劑按比例加入到第一步已滅菌的酶液內。第21頁/共54頁第二十一頁，共55頁。2）配制CaCl2.2H2O0.16mol/L

（pH5.8-6.2用于懸浮原生質體）

3)PEG液：

30%（w/v)PEG(MW=6000)

CaCl2.2H2O0.01mol/L

kH2PO40.00074mol/L

山梨醇0.1mol/L

調pH5.8-6.2；用時現配！第22頁/共54頁第二十二頁，共55頁。4）電融合液：

甘露醇0.6M

CaCl2.2H2O0.5mM

pH~5.8第23頁/共54頁第二十三頁，共55頁。3.儀器

1）大型儀器：

高壓滅菌鍋，超凈工作臺，離心機，倒置顯微鏡，電融合儀。第24頁/共54頁第二十四頁，共55頁。2）一般實驗用品

大小培養(yǎng)皿，小燒杯，小滴管，刻度離心管，小漏斗，不銹鋼網300目第25頁/共54頁第二十五頁，共55頁。五.實驗步驟

實驗路線：

煙草葉肉及洋蔥根尖原生質體酶解分離

提純原生質體并調整原生質體密度a.調整融合儀參數，電擊使原生質體融合b.PEG法使原生質體融合倒置顯微鏡觀察并照相第26頁/共54頁第二十六頁，共55頁。實驗步驟：1.取酶儲液10ml，分別加入纖維素酶和果膠酶0.08g,0.1g，制備酶液。2.取材：煙草、洋蔥根尖各0.7g

取洋蔥根尖，并將其切成0.5cm長短大小放入小平皿中；取煙草葉片將其剪成0.5cm2大小放入小平皿中。3.酶解：將酶液等量加入到存有實驗材料的平皿中，放入250c培養(yǎng)箱酶解。洋蔥約4h，煙草約3h。第27頁/共54頁第二十七頁，共55頁。4.觀察酶解效果5.原生質體的分離和純化

1）酶解后，用300目銅網過濾酶液，去除未酶解的雜質，將濾液收集在10ml離心管中。

2）1000轉/分離心3分鐘，用吸管或移液槍棄上清（注意不要把收集的原生質體吸走）。

3）用CaCl2.2H2O

（約1ml）懸浮下面的原生質體（PEG法）；電融合法則用電融合液懸浮。

4）顯微鏡觀察提純后的原生質體，若雜質較多可重復1）～3）操作。第28頁/共54頁第二十八頁，共55頁。純化的原生質體圖示完整洋蔥原生質體（40×）

完整煙草原生質體（40×）第29頁/共54頁第二十九頁，共55頁。6.原生質體的密度測定用血細胞記數板記數。每一樣品測定3次，根據測定結果，將懸浮原生質體密度調整至5*105個/ml。7.原生質體的融合（一）PEG法

1）配制PEG液（5ml）

30%（w/v)PEG(MW=6000)1.5gCaCl2.2H2O0.0074gkH2PO40.0005

g

山梨醇0.0911g

調pH5.8～6.2第30頁/共54頁第三十頁，共55頁。2）將兩種原生質體懸液等量混合3）用刻度吸管將混合的原生質體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿7~8滴，每滴約0.1ml。然后靜置10分鐘，使原生質體貼在皿底上，形成一薄層（應有3~5個平皿的重復）。4）用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質體液滴上，再靜置10~15分鐘。此時可取一個平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質體間的粘連。第31頁/共54頁第三十一頁，共55頁。PEG法原生質體的融合圖示1、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質體融合（40×）

2、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質體的異源融合

第32頁/共54頁第三十二頁，共55頁。（二）電融合法

1）融合儀參數設置：成串電流頻率0.5MHz,電壓30V,成串時間1min,融合脈沖幅寬40μS,融合電壓150v,融合槽間距1mm2）在融合小室中加入約100ul的原生質體懸浮液，將融合小室接好電極后至于倒置顯微鏡下，靜置約3min，使懸浮的原生質體沉降到平板底部，同時打開成串脈沖輸出開關及融合脈沖輸出開關，使高壓脈沖發(fā)生電路與融合小室接通。然后輕觸脈沖觸發(fā)開關，施加3次融合脈沖，每次間隔1s。融合脈沖后成串脈沖再保持1min。靜置融合小室20～30min，在顯微鏡下觀察融合過程。第33頁/共54頁第三十三頁，共55頁。電融合法原生質體的融合結果原生質體成串（40×）

原生質體融合（圖1）第34頁/共54頁第三十四頁，共55頁。電融合法原生質體的融合結果

原生質體融合（圖2）

原生質體融合（圖3）第35頁/共54頁第三十五頁，共55頁。OverallaimsofresearchTo“capture”diseaseresistancefromwildpotatospeciesTousesegregatingpopulationstoidentifyplantdiseaseresistancegenesandtransferresistanceintopotatocultivarsSOMATICHYBRIDIZATIONINSOLANUM第36頁/共54頁第三十六頁，共55頁。SomatichybridizationusingprotoplastfusionIsolateprotoplasts(typicallyleafmesophyll)fromtwoparentallinesFuseprotoplastseitherchemically(PEG)orusingelectrofusionCellmembranesfuseformingonecellcontaining2nucleiOncelldivisionnuclearmaterialcondensestogetherandhybridscellsareformedthatcontainDNAfrombothparentallines.第37頁/共54頁第三十七頁，共55頁。

Potatoplantsgrowinginatesttube第38頁/共54頁第三十八頁，共55頁。Freshlyisolatedpotatoprotoplasts第39頁/共54頁第三十九頁，共55頁。Twoprotoplastsreadytofusetogether第40頁/共54頁第四十頁，共55頁。

Fusionproductsbegintodivideonnutrientmedium第41頁/共54頁第四十一頁，共55頁。Iftheconditionsareright,smallshootsemergefromthegreencalli第42頁/共54頁第四十二頁，共55頁。Putativesomatichybridplants第43頁/共54頁第四十三頁，共55頁。

Afertilesomatichybrid

第44頁/共54頁第四十四頁，共55頁。Phenotypeofsomatichybridsclearlyshowscharacteristicsofbothparents

S.brevidenssomatichybridS.tuberosum第45頁/共54頁第四十五頁，共55頁。Phenotypeofintraspecificdiploidsof

S.tuberosum

US-W9310.3SomatichybridUS-W9545.99第46頁/共54頁第四十六頁，共55頁。SomatichybridshaveALLofthechromo