生科第十三章DNA的生物合成第一頁，共五十頁，2022年，8月28日DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則生物的遺傳信息從DNA傳遞給mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過程，被稱為翻譯。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則(Centraldogma)

。第二頁，共五十頁，2022年，8月28日Reversetranscription第三頁，共五十頁，2022年，8月28日一、DNA復(fù)制的概況（一）DNA半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)子代分子DNA的一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。[實(shí)驗(yàn)證據(jù)]：

1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度梯度離心實(shí)驗(yàn)。將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作Cscl密度梯度離心。第四頁，共五十頁，2022年，8月28日密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果[14N-15N][14N]DNA[15N]DNA[14N-15N]第五頁，共五十頁，2022年，8月28日第六頁，共五十頁，2022年，8月28日復(fù)制子(replicon)：基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。復(fù)制起點(diǎn)：

DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起點(diǎn)(origin)。在復(fù)制起點(diǎn)形成“復(fù)制叉”。原核：僅含一個(gè)。真核：多個(gè)起點(diǎn)，形成多個(gè)“泡”或“眼”。復(fù)制方向：一個(gè)起點(diǎn)一個(gè)叉，同方向合成兩條鏈。一個(gè)起點(diǎn)2個(gè)叉，不同方向合成兩條鏈。（二）DNA復(fù)制的起點(diǎn)與方向第七頁，共五十頁，2022年，8月28日AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

第八頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA的雙向和單向復(fù)制環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的θ結(jié)構(gòu)起點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉

起點(diǎn)

起點(diǎn)

起點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制多起點(diǎn)復(fù)制第九頁，共五十頁，2022年，8月28日二、原核生物DNA的復(fù)制DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymorase，PolⅠ）

——1956年,Kornberg首先從大腸桿菌提取功能特點(diǎn)聚合作用：5`→3`，在引物的3′延伸。合成20個(gè)核苷酸即離開模板，填充空隙。3`→5`外切酶活性：校對(duì)功能5`→3`外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)（一）參與原核生物DNA復(fù)制的酶和蛋白第十頁，共五十頁，2022年，8月28日主要功能：填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙校對(duì)功能切除引物，DNA損傷的修復(fù)第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)3′5′5′3′3′5′5′3′

模板引物

dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能延長因子核心酶校對(duì)引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化2.PolⅡ和PolⅢpol：

5’3’DNA合成

3’5’外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。polⅢ:主要負(fù)責(zé)DNA鏈的延伸。亞基作用：識(shí)別引物并使DNA母鏈與引物鏈結(jié)合。第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶活性5′-3′核酸外切酶活性活性DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++600120，000100++-30140，00010-20+++9000比較項(xiàng)目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修復(fù)復(fù)制功能第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日（二）大腸桿菌DNA復(fù)制的起始DNA復(fù)制的不連續(xù)片段需要在引發(fā)體(primosome)作用下合成RNA引物。

新DNA的一條鏈?zhǔn)前?′-3′方向（與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致）連續(xù)合成的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈（leadingstrand）。第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日（三）DNA鏈的延伸（1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制中的不連續(xù)片段（約1000-2000個(gè)核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragment)。

新DNA的一條鏈?zhǔn)前?′-3′方向（與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致）連續(xù)合成的，這股鏈稱為先導(dǎo)鏈（leadingstrand）。岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日另一股鏈的合成是不連續(xù)的，即先按5′-3′方向（與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致）合成若干短片段（岡崎片段），再通過酶的作用將這些短片段連在一起構(gòu)成第二條子鏈，稱為后隨鏈（laggingstrand）。先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuousreplication

）

。岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶在合成岡崎片段時(shí)，需要一個(gè)RNA短片斷作為引物(primer)

。具有3’端自由羥基（3’-OH）。引發(fā)體(primosome)：由引物合成酶和多種蛋白因子組成復(fù)合物。作用：合成RNA引物，沿后隨鏈復(fù)制叉的行進(jìn)方向移動(dòng)，在不同部位，合成RNA引物。引物合成酶（primase）：以DNA為模板，自5’3’合成10-60核苷酸的RNA小片段。引物RNA上的核苷酸單位通過PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解除去。通過PolⅠ的聚合酶活性配上與模板互補(bǔ)的脫氧核苷酸。（2）岡崎片段的RNA引物第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日（3）DNA連接酶（ligase）

催化一條DNA鏈的3′-羥基與相鄰的另一條DNA鏈的5′-磷酸根之間的磷酸二酯鍵的合成。使岡崎片段相互連接形成后隨鏈。后隨鏈的生成步驟：起始：RNA引物的合成延長：向引物RNA3′-端添加DNA順序，合成短的DNA片段終止：RNA引物脫落并帶以相應(yīng)的DNA順序，用共價(jià)鍵連接各DNA短片段第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日（4）母本DNA雙鏈的分離DNA解鏈酶/DNA解螺旋酶（DNAhelicase）打斷氫鍵，使復(fù)制叉前方的DNA雙鏈解開。單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）結(jié)合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）/拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ）兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，松弛DNA超螺旋，便于解鏈。第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日（5）DNA聚合酶的“校對(duì)”作用DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程：起始時(shí)以RNA作為引物。

DNA聚合酶的高度專一性（遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律）。

DNA聚合酶的校對(duì)功能（錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除）。第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶錯(cuò)配堿基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向旋轉(zhuǎn)酶PolⅢ解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈后隨鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

旋轉(zhuǎn)酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物（1）DNA解鏈酶（DNAhelicase）（2）DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）（3）單鏈結(jié)合蛋白（SSB）（4）引物合成酶（primase）

（5）DNA聚合酶III（6）DNA聚合酶I（7）DNA連接酶（DNAligase）第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日三、真核生物DNA的復(fù)制（1）真核細(xì)胞DNA復(fù)制有多個(gè)起始點(diǎn)。（2）至少有5種DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶（Telomerase）催化復(fù)制。第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日生物細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)：1、復(fù)制是半保留的。2、復(fù)制起始于細(xì)菌或病毒的特定位置，真核生物有多個(gè)起始點(diǎn)。3、復(fù)制可以朝一個(gè)方向，也可以向兩個(gè)方向進(jìn)行，后者更為常見。4、復(fù)制時(shí)，DNA的兩條鏈都從5′端向3′端延伸。5、復(fù)制時(shí)半不連續(xù)的。第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日四、逆轉(zhuǎn)錄作用(reversetranscription)

——RNA指導(dǎo)下的DNA合成1970年Temin和Baltimore同時(shí)從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄作用：以RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，由dNTP聚合成互補(bǔ)DNA

（cDNA）的作用，新生cDNA分子存有RNA基因組的信息。

[體系]：RNA模板、反轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP、Zn2+5’-3’方向聚合。進(jìn)入細(xì)胞后放出病毒RNAcDNA整合進(jìn)宿主染色體。利用反轉(zhuǎn)錄酶可制造任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的cDNA

。第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日反轉(zhuǎn)錄作用的意義：1、補(bǔ)充了中心法則。2、加深了對(duì)病毒致癌的認(rèn)識(shí)。病毒致癌理論3、利用反轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行基因操作，制備cDNA。第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日1、DNA復(fù)制需要：

DNA聚合酶Ⅲ；(2)解鏈蛋白；(3)DNA聚合酶Ⅰ；(4)DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶；(5)DNA連接酶參加。其作用的順序是：（）A、(4)(3)(1)(2)(5)B、(4)(2)(1)(3)(5)C、(2)(3)(4)(1)(5)D、(2)(4)(1)(3)(5)2、DNA上某段堿基順序?yàn)?’-ACTAGTCAG-3’，轉(zhuǎn)錄后的上相應(yīng)的堿基順序?yàn)椋海ǎ〢、5’-TGATCAGTC-3’B、5’-UGAUCAGUC-3’C、5’-CUGACUAGU-3’D、5’-CTGACTAGT-3’第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日五、DNA的損傷與修復(fù)

DNADamage(Mutation)andRepair損傷原因：物理因素（紫外線、各種輻射），形成嘧啶二聚體化學(xué)因素（烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類似物）

UV第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日遺傳物質(zhì)的改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。突變實(shí)質(zhì)：DNA分子上堿基的改變。

生物自身具有精確、嚴(yán)密的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，對(duì)于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS修復(fù)。

第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日1、直接修復(fù)光復(fù)活酶(photolyase)

UV第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日2.切除修復(fù)（excisionrepair）內(nèi)切酶在二聚體處切斷單鏈DNA；5′-核酸外切酶切除含嘧啶二聚體的寡核苷酸片段；DNA聚合酶在斷口處進(jìn)行局部修復(fù)合成；連接酶將新合成的DNA鏈與原DNA鏈連接在一起。3.應(yīng)急反應(yīng)修復(fù)和重組修復(fù)第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日六、DNA重組與克隆基因重組——在體外將目標(biāo)基因的DNA片段與載體連接形成重組體。DNA克隆——由單一DNA片段復(fù)制成許多相同DNA片段的過程。第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選DNA“克隆”過程第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日本章重點(diǎn)半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、岡崎片段、多順反子、單順反子、前導(dǎo)鏈、后隨鏈參與DNA復(fù)制的有關(guān)酶類和蛋白質(zhì)及DNA的復(fù)制過程第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日PCR（polymerasechainreaction）是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，類似于天然DNA復(fù)制。靶DNA分子變性解鏈；在4種dNTP存在和合適和條件下，由DNA聚合酶酶促反應(yīng)，由5’－3’擴(kuò)增延伸，形成兩條新的雙鏈DNA分子，并作為下一循環(huán)的模板；經(jīng)過30～50個(gè)循環(huán)，可使原DNA量擴(kuò)增數(shù)百萬倍。9.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)與DNA擴(kuò)增第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日（七）細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內(nèi)切酶——能識(shí)別DNA特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶。如果識(shí)別序列中的堿基被修飾，限制酶將無法起作用。限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GT—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—TG—5′粘性末端EcoRⅠ5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平頭末端HpaⅠ.第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日真核生物DNA聚合酶α、β、γ及δ四種，都有5`→3`聚合功能。α及δ參與核DNA復(fù)制；

α：鏈合成的引發(fā)，δ：鏈的延長

polδ；切除引物后填補(bǔ)空隙

β：外切核酸酶

γ：線粒體DNA復(fù)制第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個(gè)細(xì)胞核～80%無120，000一個(gè)細(xì)胞核和線粒體2～15%無-400，000一個(gè)細(xì)胞核+10～25%5-3外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個(gè)細(xì)胞核10～15%無第四十四頁，共五十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA第四十五頁