端粒和端粒酶與腫瘤發(fā)生的研究進展學院：生命科學學院SQrgnjKlzxcvbnm<Izxcvbnrtvuiopas指導老師：關(guān)鍵詞端粒酶;端粒酶抑制劑;腫瘤治療在諸多探索中，腫瘤細胞永生化的“端粒端粒酶學說”已為越來越多的研究結(jié)果所證實。已有的研究表明，80%?90%的惡性腫瘤中均有端粒酶的活性表達，而大多數(shù)體細胞無端粒酶的活性，由此可見端粒酶的激活在細胞永生化及腫瘤的形成中具有十分重要的作用。近年來端粒酶抑制劑的研究和開發(fā)為腫瘤治療提供了新的思路，并有可能成為腫瘤治療的突破。本文中對近年來端粒酶的最新研究進展，特別是有關(guān)端粒酶抑制劑以及在腫瘤等疾病治療中的應(yīng)用前景，進行綜述和分析。1端粒與端粒酶的生物學特性端粒是真核細胞染色體末端由重復(fù)DNA序列和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，是保持染色體完整性和穩(wěn)定性的重要結(jié)構(gòu)。Muller于1938年首次發(fā)現(xiàn)這一結(jié)構(gòu)并將其命名為端粒（telomers）。1991年，Blackburn〔1〕描述了真核生物染色體的端粒結(jié)構(gòu)并指出端粒的長度在DNA復(fù)制時不斷縮短，當端粒的長度縮短到一定程度時，細胞即停止分化而衰老死亡，這使細胞具有一定的分裂壽命。故端粒長度是決定細胞增殖能力和壽命的分子標志。而以上這一過程均由端粒酶進行調(diào)控。端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核酸蛋白酶，可以延長端粒DNA，阻滯因端?？s短誘發(fā)的細胞衰老凋亡。1985年Greider和Blackburn〔2〕首次從四膜蟲細胞提取液合成端粒的實驗中，發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性并同時證實了端粒酶具有維持端粒長度的作用。一般認為端粒酶由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相關(guān)蛋白（TP1/TP2）和端粒酶催化亞基（hTERT）3部分組成。hTERT是端粒酶的催化亞基，通過逆轉(zhuǎn)錄hTR模板序列，合成端粒DNA序列并添加到染色體末端，催化末端的端粒DNA復(fù)制和延長。hTR基因在人的組織細胞中廣泛表達，而hTERT基因只在端粒酶活性陽性的細胞中（如生殖細胞、各種具有分裂分化能力的組織干細胞和絕大多數(shù)的腫瘤細胞）表達。hTERT是控制細胞端粒酶活性的限制性成分。因此端粒與端粒酶的生物活性機制已被認為是細胞分裂、增殖的基礎(chǔ)，與細胞的衰老、永生化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。2端粒、端粒酶與腫瘤的演進近年來隨著腫瘤分子生物學的不斷發(fā)展，越來越多的研究表明絕大部分惡性腫瘤細胞的端粒長度較正常細胞縮短。自1994年，Kim〔3〕開始應(yīng)用一種靈敏的基于PCR的端粒酶檢測方法TRAP法來探測人體組織中的端粒酶活性后，研究發(fā)現(xiàn)，90%的惡性腫瘤組織中都存在端粒酶活性，在常見惡性腫瘤細胞中端粒酶活化的陽性檢出率分別為:胃癌85%、肺癌80.1%、肝癌85%、乳腺癌85%、腎癌71%、胰腺癌95%等〔4?7〕。由此可見端粒酶基因的異常激活是絕大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的共同途徑〔8?10〕。端粒酶在惡性腫瘤增殖中的重要性及其高表達率，使之成為惡性腫瘤化療和基因治療的重要靶點〔11，12〕。當端粒酶催化亞基基因在轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)既能延長細胞壽命又不影響細胞的正常功能時，延長壽命的細胞就能有效的抑制衰老，如皮膚的老化、肌肉的退縮和動脈硬化等。由此可見，端粒酶與老年人的多發(fā)腫瘤疾病也有著密切關(guān)系。故通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導其衰老凋亡而發(fā)揮治療作用的端粒酶活性抑制劑成為腫瘤基因治療的重點。3端粒酶抑制劑作用機制及治療腫瘤的研究目前基于對端粒酶結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機制的理解認為抑制端粒酶活性或基因表達的抑制劑，使腫瘤細胞不能有效合成端粒序列，從而發(fā)生“凋亡”，達到治愈腫瘤的目的。主要有以下途徑：①阻斷端粒酶RNA模板作用，抑制端粒酶活性。包括：反義hTR，反義寡核苷酸；肽苷酸；錘頭狀核酶。②對端粒酶蛋白組分的抑制劑：端粒酶蛋白抗體；PKC調(diào)節(jié)劑；hTERT抑制劑。③其他抑制劑。3.1以端粒酶RNA為靶點3.1.1反義寡核苷酸（ODN）端粒酶RNA序列中含有與DNA互補的模板序列，因此可設(shè)計能與之結(jié)合的ODN來使端粒酶失活，從而阻止端粒序列的合成。Feng〔13〕通過反義hTR轉(zhuǎn)染人Hela細胞發(fā)現(xiàn)，癌細胞系中端粒長度的維持可被與人端粒酶RNA互補的反義RNA的表達所阻斷，引起細胞危機。Mukai〔14〕等設(shè)計出通過ODN結(jié)合RNA模板區(qū)域以阻斷端粒酶活性的方法，將5磷酸化2?5寡腺苷對裸鼠的顱內(nèi)膠質(zhì)瘤進行處理，發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力降低至43%?76%，與對照組相比顯示出明顯的治療效果。Nielsen〔15〕等用多肽骨架替代ODN中核糖磷酸骨架成功地合成了肽核酸，可與DNA或RNA形成穩(wěn)定的WatsonCrick鍵，而且由于不帶電荷，其中性骨架間無排斥力，同時其分子內(nèi)部殘基間形成氫鍵，因此化學穩(wěn)定性好，Tm值高，不易被核酸酶和蛋白酶降解，且合成容易，僅需相當短的DNA序列，有望替代ODN成為良好的反義藥物。Norton〔16〕等研究了PNA在體外對端粒酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)PNA比同源類似物硫代磷酸寡聚體的抑制作用強10?50倍，且在對端粒酶的親和性及識別的特異性方面都具有優(yōu)勢。但ODN仍存在一些尚需解決的難題：①穿透性，即細胞攝取ODN的效率有待提高；②穩(wěn)定性，即ODN易被核酸酶降解；③有效性，ODN的非特異性結(jié)合降低了其效力；④毒性作用。3.1.2核酶核酶是一種存在于細胞核具有核酸內(nèi)切酶活性的小分子RNA，不僅與靶序列反義結(jié)合，而且特異性將其水解，又稱“基因剪刀”。Kanazawa〔17〕等制備了直接作用于人端粒酶RNA成分的錘頭狀核酶（teloRZ）,加入從人干細胞癌衍生出的HepC2及Huh7細胞提取物，teloRZ均顯示出對端粒酶的抑制作用。Yokoyama（18〕等針對hTR3'端不同序列為靶點設(shè)計了3個錘頭型核酶，將其RNA導入Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞，細胞的端粒酶活性降低，其中以模板區(qū)為靶點的核酶具有最強的降解端粒酶活性的效力，并導致了端粒的縮短。與一般反義寡核苷酸相比較核酶抑制端粒酶活性的作用較為確切，將有望成為廣譜、低毒、高效的抗癌新藥。3.1.3以端粒酶作用的底物端粒為靶點hTR以其自身為模板反轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA過程中，依賴4種三磷酸單核苷酸的參與，故可利用核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄過程，以抑制端粒酶活性，阻止端粒延長，從而使腫瘤細胞凋亡。目前認為核苷類似物共同作用機制可能為：①底物抑制作用，即核苷類似物與端粒酶活性位點結(jié)合，形成失活的端粒酶與核苷復(fù)合物，從而抑制端粒酶活性。②核苷類似物摻入端粒DNA中，形成不穩(wěn)定DNA端粒酶DNA復(fù)合物，或因構(gòu)象改變而導致合成中的端粒酶DNA從端粒酶中解離。③7脫氧dNTP阻礙鳥嘌吟四聚體等二級結(jié)構(gòu)形成，導致端粒合成受阻。Izbicka小組基于獨特的端粒二級結(jié)構(gòu)設(shè)計了新型的端粒酶抑制方法，即靶向它的底物端粒。這種獨特的二級結(jié)構(gòu)就是由端粒酶合成的突出的富含G的單鏈折疊而成的G四聯(lián)體。他們已確認了一系列的陽離子卟啉作為G四聯(lián)體相互作用因子(QIAs)，能穩(wěn)定G四聯(lián)體，通過妨礙端粒與端粒酶結(jié)合而間接抑制端粒酶活性，而且卟啉很容易進入培養(yǎng)的腫瘤細胞核內(nèi)。并通過實驗研究表明卟啉可在某一濃度選擇性抑制端粒酶活性而不會對其他細胞產(chǎn)生普遍的毒性作用，從而獲得恰當?shù)纳飳W效應(yīng)。3.2以端粒酶hTERT為靶點3.2.1蛋白激酶C(PKC)抑制劑PKC信號傳遞系統(tǒng)是細胞內(nèi)相當普遍的第二信號傳導系統(tǒng)。PKC家族的激活是生長因子刺激的細胞活動中心環(huán)節(jié)之一〔19〕。TP1和TP2是磷蛋白，其磷酸化作用是端粒酶活化所必需。PKC能介導TP1和TP2的磷酸化而激活端粒酶。PKC抑制劑發(fā)揮其抑制端粒酶活性的作用可能是通過導致某些效應(yīng)分子的失活，而這些效應(yīng)分子對端粒酶發(fā)揮活性是必需的。已經(jīng)證明PKC抑制劑bisindolymaleimidel和H7能有效抑制鼻咽癌NPC076細胞中端粒酶的活性〔20,21〕。3.2.2端粒酶蛋白抗體端粒酶蛋白是維持酶結(jié)構(gòu)和功能所必需，抑制此類蛋白的功能可導致端粒酶失活。但目前尚無滿意的人類端粒酶蛋白抗體。3.3其他抑制劑對端粒酶活性的影響已有的研究表明腫瘤細胞的不同分裂時期，其端粒酶活性不同，隨著細胞進入G1/S期，端粒酶活性逐漸增加，在復(fù)制S期端粒酶活性最高，而在G2/M期端粒酶活性逐漸消失。二甲基亞砜（DMSO）為G0/G1期阻斷劑，能阻斷Raji細胞進入細胞分裂周期。如何能抑制S期端粒酶活性的細胞周期可能是腫瘤治療的一個重要手段。分化不良的惡性腫瘤細胞端粒酶活性一般很高，但終末分化的正常人體細胞卻無端粒酶活性表達。Bestilny〔22〕等研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸（RA）和TPA在誘導HL60白血病細胞等永生化細胞終末分化時，可明顯抑制細胞端粒酶活性，并使凋亡細胞增多。但這些誘導劑本身并不能直接抑制端粒酶活性，而是由細胞分化所造成的。肝素是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑之一，而且有研究表明酶的活性位點在已知的DNA聚合酶、RNA復(fù)制藥、反轉(zhuǎn)錄酶以及依賴DNA的RNA聚合酶中都是高度保守的，因此，由于端粒酶是逆轉(zhuǎn)錄酶的一種，凡是能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物都能抑制端粒酶活性，Mueller〔23〕等人證實了肝素對端粒酶的抑制作用。另外，用某些細胞生殖抑制劑如乙酸鈉處理人細胞引起了端粒酶活性下降，在存在氨酸磷酸酶抑制劑磯酸鹽時，乙酸鹽對端粒酶及細胞生長抑制作用得以加強。4問題與展望隨著對端粒酶結(jié)構(gòu)，作用機制，表達調(diào)控和端粒酶與腫瘤關(guān)系的深入研究，通過抑制端粒酶活性來抑制腫瘤的生長在腫瘤化療方面有很廣闊的應(yīng)用前景。但是端粒酶抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療時仍存在一些急需解決的問題：如，由于現(xiàn)在對端粒的動力學，端粒酶的結(jié)構(gòu)成分，其活性的調(diào)節(jié)機制和在腫瘤細胞中的激活機制還不是完全清楚，如何針對不同的腫瘤選擇最有效的抑制劑仍需進行大量的進一步研究和探索。端粒酶在人體某些組織和細胞中如干細胞，生殖細胞，淋巴細胞，造血干細胞和其他組織中都有表達。端粒酶抑制劑治療腫瘤時對這些組織有何毒性，應(yīng)如何預(yù)防與應(yīng)用，尚需進一步的深入研究。迄今為止，關(guān)于端粒酶抑制劑的研究大多局限于體外實驗觀察，其近期及遠期毒副作用有待更進一步觀察和驗證。雖然仍有許多問題還有待深入的研究解決，但端粒酶及其抑制劑已是當今腫瘤防治領(lǐng)域中最受關(guān)注的熱點，隨著相關(guān)問題的解決，將為腫瘤治療開辟新的途徑?！緟⒖嘉墨I】BlackburnEH.Structureandfunctionoftelomeres〔J〕.Nature,1991；350(6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