生防菌劑研究進展報告人：李紀順山東省科學院生物研究所,2015年10月山東省科學院生物研究所應(yīng)用微生物研究室，依托山東省應(yīng)用微生物重點實驗室和生物制造技術(shù)研發(fā)平臺，長期從事生防菌劑的研究開發(fā)工作，先后研制了木霉菌母藥、木霉菌制劑5個（登記證號PD20096832、LS20061652、PD20096833、PD20101573、PD20131786、），芽胞桿菌生物殺菌劑1個（登記證號為PD20094534），微生物肥料6個，取得了較好的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益;獲得省級以上獎勵10余項，其中省部級一等獎3項。前期研究成果近年來，在霜霉病、灰霉病、根結(jié)線蟲的生物防治工作中，又有新的收獲。新篩選到的芽孢桿菌BCJB01和BMJBN02對葡萄霜霉病的防效分別為84.05%和73.30%，且菌株已被開發(fā)成懸浮劑和粉劑兩種劑型，活菌數(shù)量分別為30×108和100×108CFU；新篩選的木霉WS1-10、GD1-3、TW20256和TW20111對灰霉病的抑制率為75%；新篩選的木霉T11-W對根結(jié)線蟲卵的寄生率為73.46%，新篩選的芽孢桿菌BCJB01對根結(jié)線蟲的防效為76.64%。近兩年研究成果BCJB01和BMJBN02對霜霉病孢子囊及游動孢子降解作用的顯微觀察霜霉病霜霉病BCJB01和BMJBN02對霜霉病孢子囊及游動孢子降解作用的顯微觀察顯微觀察結(jié)果：在相同的處理條件下，水對照中孢子囊萌發(fā)明顯；波爾多液處理孢子囊均變形，導(dǎo)致孢子囊不能正常萌發(fā)；生防細菌BMJBN02可使孢子囊變形，但對已萌發(fā)出來的游動孢子無作用；而BCJB01并不抑制孢子囊的萌發(fā)，菌體圍繞在孢子囊周圍，在萌發(fā)口處等待游動孢子，待游動孢子游出后將其分解。霜霉病生防細菌胞壁降解酶活性測定幾丁質(zhì)酶活性測定霜霉病纖維素酶活性測定霜霉病β-1,3-葡聚糖酶活性測定霜霉病BCJB01和BMJBN02的鑒定BCJB01和BMJBN02的形態(tài)特征及生理生化測定標準參照沈萍等和東秀珠等的方法進行；以菌株BCJB01和BMJBN02基因組DNA為模板，提取方法參照蔣萍，用細菌通用引物擴增16SrDNA序列，并將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送山東農(nóng)科院測序中心測序。將測得的序列在NCBI中進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)BCJB01和BMJBN02分別為蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）和巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）。霜霉病BCJB01和BMJBN02對葡萄霜霉病的室內(nèi)防效實驗供試菌劑：BCJB01和BMJBN02LB液體發(fā)酵稀釋10倍液葡萄品種：澤山1號葉盤法檢測菌株BMJBN02和BCJB01室內(nèi)試驗結(jié)果霜霉病BCJB01和BMJBN02懸浮劑對葡萄霜霉病的田間實驗試驗按農(nóng)業(yè)部藥檢所田間試驗準則設(shè)計。實驗統(tǒng)計結(jié)果見下表

BCJB01和BMJBN02懸浮劑田間防效霜霉病霜霉病葡萄潰瘍病處理1BAB-1稀釋60倍；處理2W10稀釋5倍；處理311K1稀釋5倍；CK水處理4BMJBN02稀釋50倍；處理5BCJB01稀釋50倍；處理630%嘧菌酯稀釋1500倍

試驗數(shù)據(jù)由中國農(nóng)業(yè)大學張立群教授提供葡萄品種：紅地球

葡萄品種：毛葡萄防治灰霉病的木霉資源篩選已獲得木霉菌株500余株。發(fā)現(xiàn)4株木霉菌對番茄灰霉病有良好的防治效果灰霉病26省1203個樣品灰霉病

LTR-2WS1-10GD1-3灰霉病拮抗霉病情指數(shù)p=0.05p=0.01防效%拮抗菌病情指數(shù)p=0.05p=0.01防效%T91-248.13aA20.3T16-226.11deDE56.7T6-345.26aA25.0gD324.97deDE58.6T9-443.55abAB27.9gD1-321.87defDE63.8T10-136.78bcBC39.1LTR-219.67defEF67.4T8-236.11bcBC40.2WS1-1018.62defEF69.2T1132.55cdCD46.1CK60.37--

拮抗木霉防治黃瓜灰霉病的室內(nèi)試驗結(jié)果利用ATMT方法構(gòu)建了綠色木霉LTR-2的突變體庫篩選方法：突變體對番茄灰霉菌的重寄生能力進行篩選結(jié)果：T2-60、T2-58生防木霉菌LTR-2的遺傳改良

AB顯微鏡下觀察突變子對灰霉病菌絲的結(jié)合位點和接觸纏繞情況

A纏繞程度強B纏繞程度弱將幾丁質(zhì)酶基因chi42和葡聚糖酶基因glu14串聯(lián)在同一個表達載體上，并利用ATMT手段將雙價抗病基因?qū)刖G色木霉LTR-2基因組DNA上，獲得具有雙價抗病基因的重組菌株L-15。生防木霉菌LTR-2的遺傳改良

遺傳改良木霉防治番茄灰霉病的室內(nèi)試驗結(jié)果木霉菌LTR-2的液-固發(fā)酵新工藝:液體發(fā)酵(種子)：1%葡萄糖，4%玉米粉，2%豆餅粉，0.05%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，0.02%消泡劑，pH6.0，培養(yǎng)條件：30℃，轉(zhuǎn)速150r/min，通氣量1：0.5～1；固體發(fā)酵：麥?；蛴衩琢?，添加10%稻殼，接種量3%；發(fā)酵培養(yǎng)條件：水分控制在55%±5%，培養(yǎng)條件：溫度控制在26℃-35℃，料厚5-10CM，濕度45%-55%，培養(yǎng)時間48-72h；產(chǎn)量：50×108cfu/克固料木霉發(fā)酵工藝及制劑的研究

木霉發(fā)酵工藝及制劑的研究木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子發(fā)酵工藝：1、碳、氮源及無機鹽的確定木霉發(fā)酵工藝及制劑的研究2、培養(yǎng)基質(zhì)量分數(shù)正交實驗?zāi)久拱l(fā)酵工藝及制劑的研究最優(yōu)組合：可溶性淀粉質(zhì)量分數(shù)2%、豆粕質(zhì)量分數(shù)5%、FeSO4·5H2O0.02%，誘導(dǎo)劑量1‰，誘導(dǎo)劑加入時間24小時，pH6.0。厚垣孢子總數(shù)為1.5×108cfu/ml。木霉懸浮種衣劑助劑的篩選通過嘗試法對8種潤濕分散劑、3種成膜劑進行了篩選，結(jié)果如下：觀測結(jié)果表明，對照CK嚴重絮凝，而十二烷基苯磺酸鈉懸浮率可達92.5%，此外木霉LTR-2在2%十二烷基苯磺酸鈉濃度下活性基本沒有影響，同時價格便宜，因此，選擇作為種衣劑的潤濕劑。木霉懸浮種衣劑助劑的篩選綜合其粘度、包衣脫落率和包衣均勻度來考查其成膜性能，選用2%的聚乙烯醇水溶液作為懸浮種衣劑的成膜劑最為合適。初選配方木霉懸浮種衣劑助劑的篩選制備木霉懸浮種衣劑的理化性質(zhì)穩(wěn)定，懸浮效果好，pH適宜，成膜時間短，包衣效果好，脫落率低，并且長時間儲存不分層結(jié)塊，制劑的質(zhì)量穩(wěn)定，60天木霉活孢子存活率在65-70%。線蟲

木霉T11-W寄生根結(jié)線蟲卵T11-W對南方根結(jié)線蟲卵具有寄生作用，校正寄生率為73.

46%，相對孵化抑制率為94.

19%。田間試驗表明，T11-W對番茄根結(jié)線蟲