糖化酶的固定化試驗(yàn)一、 目的要求本實(shí)驗(yàn)為酶工程綜合實(shí)驗(yàn)，由學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的能力；并掌握酶活測(cè)定方法，米氏常數(shù)測(cè)定，學(xué)習(xí)固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。二、 基本原理糖化酶是一種用途廣泛的酶，糧食工業(yè)、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)都經(jīng)常使用。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，糖化酶的生產(chǎn)和使用水平也有了進(jìn)一步的提高。固定化技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的一種嶄新技術(shù)，固定化酶同游離酶相比有很多優(yōu)點(diǎn),它開辟了酶的許多新用途。游離酶可通過各種固定化方法，增加其穩(wěn)定性并且有利于連續(xù)化生產(chǎn)和重復(fù)使用。酶固定化后可用各種理化性質(zhì)的變化來表征其效果。酶的固定化方法：通常的固定化方法可以概括為四種：a、吸附法b、共價(jià)偶聯(lián)法c、交聯(lián)法d、包埋法4、包埋法包埋法是借助于聚合促進(jìn)劑的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋于聚合物中以達(dá)到固定化目的的一種方法。反應(yīng)條件溫和，很少改變酶的結(jié)構(gòu)，此方法對(duì)大多數(shù)酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都是適用的，其局限性是①、對(duì)底物和產(chǎn)物是大分子的采用此種方法固定化酶是不適用的②、高聚物網(wǎng)絡(luò)或半透性膜對(duì)小分子物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶的動(dòng)力學(xué)行為偏離游離酶的動(dòng)力學(xué)行為，活力減低。凝膠包埋是將酶包埋在交聯(lián)的水不溶性凝膠的空隙中的方法，把酶固定于聚合材料的格子結(jié)構(gòu)中，這樣可以防止酶蛋白游離釋放，但底物仍能滲入格子內(nèi)與酶接觸，進(jìn)行酶催化反應(yīng)。糖化酶活力的測(cè)定采用次碘酸鈉法。糖化酶能從淀粉分子非還原性末端開始，分解a-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，由此可計(jì)算酶活力。次碘酸鈉法的原理為在堿性介質(zhì)（NaOH）中，碘歧化為次碘酸鈉和碘化鈉，次碘酸鈉氧化溶液中游離的醛基為酸基。適當(dāng)酸化，剩余的次碘酸鈉與碘酸鈉又生成碘，以淀粉為指示劑，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)總碘量和硫代硫酸鈉的用量，可對(duì)應(yīng)獲得甲醛的量。反應(yīng)為：I2+2OH-=OI-+I-+H2OHCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2OOI-+I-+2H+=I2+H2OI2+2S2O32-=S4O62-+2I-米氏常數(shù)Km為當(dāng)酶促反應(yīng)速度是最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。將米氏方程，兩邊取倒數(shù)得公式：，此式即為Lineweaver-Burk方程，這一線性方程，用對(duì)作圖即得一條直線，直線的斜率為Km/七成，1/v的截距為1/七成。當(dāng)1/v=0時(shí)，1/〔S〕的截距為-1/Km。即根據(jù)直線在橫軸上的截距(-1/Km)可求出米氏常數(shù)Km。三、 儀器設(shè)備與試劑儀器設(shè)備：實(shí)驗(yàn)用乳化機(jī)WL500CY、注射用筒50mL6號(hào)針頭、微量滴定管、試劑瓶、電子天平、試管、玻璃棒、容量瓶、紗布、比色管、恒溫水浴鍋玻璃儀器、試劑：(1)乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(pH為4.6)。稱取乙酸鈉(CH3COONa?3H2O)6.7g，溶于水中，加冰乙酸(CHQOOH)2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用pH計(jì)校正。硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(Na2S2O3，0.05mol/L)。碘溶液(1/2I2，0.1mol/L)。氫氧化鈉溶液(NaOH，0.1mol/L)。200g/L可溶性氫氧化鈉溶液。硫酸溶液(2mol/L)。20g/L可溶性淀粉溶液。10g/L淀粉指示液。糖化酶試劑四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 糖化酶的酶活測(cè)定2、 糖化酶的米氏常數(shù)測(cè)定3、 根據(jù)所學(xué)知識(shí)設(shè)計(jì)糖化酶的固定化方法(重點(diǎn)為包埋法)4、 設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)固定化后的糖化酶進(jìn)行表征。(固定化酶的活力，活力回收測(cè)定,固定化酶的半衰期，固定化酶的Km測(cè)定)五、實(shí)驗(yàn)步驟1、酶活測(cè)定酶活定義：1g固體酶粉（或1ml液體酶），于40°C、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g（u/ml）表示。原理：糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解3-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算酶活力。糖化酶固定化機(jī)理:海藻酸鈉是糖醛酸的鈉鹽聚合物在酸性條件下可形成凝膠，明膠是一種多肽聚合物,在一定pH條件下，帶正電荷的明膠與海藻酸根陰離子形成聚合物，同時(shí)海藻酸鈉與鈣離子在一定條件下結(jié)合形成不溶于水的微球從水中分離出來。戊二醛含有二個(gè)醛基，可與蛋白質(zhì)中的氨基、酚基、巰基發(fā)生Schiff反應(yīng),相互交聯(lián)而使固定化酶硬化，由于正電荷的明膠與海藻酸根陰離子形成聚合物已將絕大部分游離酶包埋起來因此這種交聯(lián)主要發(fā)生在明膠與戊二醛之間，實(shí)驗(yàn)也證明這種交聯(lián)對(duì)酶活力的損失并不大,但卻能達(dá)到使固定化酶的使用時(shí)間延長、機(jī)械強(qiáng)度增大、穩(wěn)定性提高的效果（1） 待測(cè)酶液的制備稱取酶粉1?2g，精確至0.0002g（或吸取液體酶1.00ml），先用少量的乙酸緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量緩沖液，如此搗研3?4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（估計(jì)酶活力在100?250u/ml范圍內(nèi)），搖勻。通過4層紗布過濾，濾液供測(cè)定用。（2） 測(cè)定于甲、乙兩支50ml比色管中，分別加入可溶性淀粉25ml及緩沖液5ml，搖勻后，40C恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）中加入待測(cè)酶液2ml，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立刻各加入氫氧化鈉溶液0.2ml，搖勻，將兩管取出迅速冷卻，并于乙管（空白）中補(bǔ)加待測(cè)酶液2ml，吸取上述反應(yīng)液與空白液5ml，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘溶液10ml，再加氫氧化鈉溶液15ml，搖勻，密塞，于暗處反應(yīng)15min。取出，加硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至藍(lán)色剛好消失為其終點(diǎn)。（3） 計(jì)算X=（A—B）cx90.05x32.2/5x1/2xnx2=579.9x（A—B）cxn式中X 樣品的酶活力（u/g或u/ml）A——空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積（ml）B—樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積（ml）c——硫代硫酸鈉溶液的濃度（mol/L）90.05——與1ml硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mol/L）相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜钠咸烟堑馁|(zhì)量32.2——反應(yīng)液的總體積（ml）5——吸取反應(yīng)液的體積（ml）1/2—吸取酶液2ml，換算為1mln—稀釋倍數(shù)2—反應(yīng)30min，換算成1h的酶活力系數(shù)所得的結(jié)果表示至整數(shù)2、 米氏常數(shù)測(cè)定配制2%濃度的可溶性淀粉溶液，用5支試管分別加入2,4,6,8,10mL，不足的補(bǔ)加蒸餾水至10mL。分別加入相同的酶液，測(cè)酶活。3、 固定化方法將酶液15mL與3%的海藻酸鈉溶液150mL混合攪拌，然后加入3%的明膠溶液150mL混合乳化約10min，調(diào)pH4,慢速攪拌并降溫至5~10度，通過6號(hào)注射器的針頭將上述冷卻液以5cm的高度注進(jìn)1%氯化鈣溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持溫度為4度，硬化30min。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄游離酶的酶活力測(cè)定表1：游離酶活力測(cè)定記錄表空白122%可溶性淀粉/mL101010pH4.6醋酸緩沖液/mL555操作40°C預(yù)熱10min酶液/mL1（滅活酶）11操作40C反應(yīng)10min，立即轉(zhuǎn)入100C滅活上述反應(yīng)液/mL5550.1mol/L碘液/mL5550.1mol/LNaOH/mL555操作搖勻，暗處放置15min2mol/L^SO/mL2220.5%淀粉指示劑/滴3330.025mol/LNa2S2O3滴定至終點(diǎn)消耗體積/mL

游離酶米氏常數(shù)的測(cè)定表2：游離酶米氏常數(shù)測(cè)定記錄123451%可溶性淀粉/mL246810蒸餾水/mL86420pH4.6醋酸緩沖液/mL55555酶液/mL11111操作40°C反應(yīng)10min后，100°C滅活上述反應(yīng)液/mL555550.1mol/L碘液/mL555550.1mol/LNaOH/mL5555