實驗五堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日一、目的要求1.學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法2.學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速度（Vm）的測定原理和方法，測出堿性磷酸酶在以對硝基苯酚磷酸為底物時的Km

和Vm值。第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性分析1．原理第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日2．主要方法：（1）比較吸收光譜曲線（2）比較最大吸收波長

蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm，核酸的最大吸收波長為260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日（3）比較吸光度的比值

純DNA第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定量分析

1．原理

Beer-Lambert（比爾）定律：

T=I/I0A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日

2．常用方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

OD或Ａ

濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測定條件必須一致。第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日（2）標(biāo)準(zhǔn)管法

CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX，可求得CX。 （3）摩爾吸光系數(shù)法

C=A/（為L=1cm，C為1mol/L時的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日(三)米氏常數(shù)的測定原理酶促反應(yīng)v-[S]曲線

v

[S]推導(dǎo)出米氏方程為：其中[S]為底物濃度；v為初速度；Vm為最大反應(yīng)速度；Km

為米氏常數(shù)

第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日 米氏常數(shù)Km是酶的一個基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力的強(qiáng)弱。

測定Km和Vm，可通過作圖法求得。最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。這個方法是將米氏方程轉(zhuǎn)化為倒數(shù)形式，即：以1/v對1/[S]作圖，可得一條直線第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日

1/v1/Vm

-1/Km1/[S]本實驗測定堿性磷酸酶催化對硝基苯磷酸鈉鹽(pNPP)水解的Km和Vm.反應(yīng)式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

無色黃色

可通過分光光度法測定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。

第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日三、試劑與器材試劑：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸鈉—碳酸氫鈉pH10.1緩沖液、0.1mol/LNaOH、6mg/mL堿性磷酸酶酶液器材：恒溫水浴鍋、722分光光度計第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日四、分光光度計的使用

第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日

1．722型分光光度計的外形第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動調(diào)整零透射比“波長設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日3.樣品測試操作①打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長設(shè)置”按鈕將波長設(shè)置在您將要使用的分析波長位置上③打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路④蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零⑤取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比⑥按“方式鍵”（MODE）將測試方式設(shè)置為吸光度方式(A)⑦將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中⑧打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋⑨將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A⑩將被測溶液拉入光路中，此時，顯示器上所顯示是被測樣品的吸光度參數(shù)實驗完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日返回第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日返回第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日返回第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日五、操作方法（一）對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取5支試管編號,0號一支,1－7號各二支,按下表操作：

管號0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm

以對硝基苯酚的絕對量(mol數(shù))為橫坐標(biāo)，OD405nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)()值。第二十頁，共二十六頁，2022年，8月28日(二）測定15支試管，1-5做兩組平行測定管，01-05作為空白對照。No.12345底物終濃度[S](mM)0.50.751.01.5

310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸餾水（mL）0.50.450.40.30

碳酸鹽緩沖液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL預(yù)熱混勻，37℃，5分鐘酶液（mL）測定管各加0.2mL酶液反應(yīng)時間37℃，精確反應(yīng)10分鐘0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各補加0.2mL酶液OD405第二十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日（三）數(shù)據(jù)處理各管在722分光光度計測定波長405nm的OD值(OD405nm)。從對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出OD405nm相當(dāng)于產(chǎn)物對硝基苯酚的含量(mol數(shù)),計算出各種底物濃度下的初速度vo（單位以molL-1min-1表示），取倒數(shù)1/v填入表內(nèi)。以1/v對1/[S]作圖，求出酶催化pNPP水解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm。第二十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日六、注意事項取液量一定要準(zhǔn)確。反應(yīng)時間一定要精確。加酶前后一定要將試劑混勻。空白對照一定要先加NaOH，后加酶。測定OD405時要以各自的空白調(diào)零點。移液管或取液器的使用比色杯的使用第二十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日返回第二十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日管號11'22'33'44'55'

加酶時間（min）0.511